一种细菌粘附细胞的快速检测方法技术

本发明专利技术提供一种细菌粘附细胞的快速检测方法，属于微生物检测领域，通过将荧光染料标记后的有益菌和病原菌同时粘附细胞；粘附过程为：将有益菌、病原菌以及N‑苄氧羰基甘氨酸和质粒DNA同时加入受体细胞，共培养进行粘附，粘附结束后，洗除未粘附的细菌，检测细胞的荧光强度，并计算粘附率。本发明专利技术检测方法操作简便、耗时短、误差小，通过探索有益菌对病原菌的抗粘附影响，可为预防某些病原菌侵染疾病的发生提供依据。

A Rapid Detection Method for Bacterial Adhesion Cells

The invention provides a rapid detection method for bacterial adhesion cells, which belongs to the field of microbial detection. The bacteria and pathogens labeled with fluorescent dyes adhere to cells at the same time. The adhesion process includes: adding beneficial bacteria, pathogenic bacteria, N benzyloxycarbonyl glycine and plasmid DNA to the recipient cells at the same time, co-culturing for adhesion, and washing the non-adherent bacteria after adhesion. The fluorescence intensity of cells was measured and the adhesion rate was calculated. The detection method of the invention has the advantages of simple operation, short time-consuming and small error. By exploring the anti-adhesion effect of beneficial bacteria on pathogenic bacteria, it can provide a basis for preventing the occurrence of some pathogenic bacteria infecting diseases.

【技术实现步骤摘要】
一种细菌粘附细胞的快速检测方法
本专利技术属于微生物检测领域，具体涉及一种细菌粘附细胞的快速检测方法。
技术介绍
粘附是病原菌入侵宿主细胞的先决条件之一。在感染过程中，病原菌通过粘附和定值后，发挥一系列致病作用。在细菌性疫病的防控中，若能阻止细菌与宿主细胞的粘附，便能有效防控该疫病的发生。判断一种药物或添加剂是否能有效减少或阻止细菌的粘附，通常需要建立一种体外细菌粘附试验模型，通过统计细菌在细胞的粘附率来确定该药物对细菌粘附的抑制效果。粘附是细菌的粘附素与宿主细胞相应受体之间的结合过程。已有研究表明,粘附素多为细菌菌毛，此外还有一些非菌毛性蛋白和糖类，而细菌所粘附的受体多为糖蛋白。由于不同的细菌，其粘附素的组成成分和分子结构不同，它们识别和结合宿主细胞受体的能力就不同，因而不同的细菌菌株对细胞的粘附能力是不同的。益生菌是一类活的微生物，能促进肠道内菌群的生态平衡，是对宿主健康有益的活菌制剂，它们也是人和动物肠道重要的生理性细菌；许多研究表明，益生菌可干扰病原菌的生长、繁殖。公开号为CN107523604A的中国专利技术专利，公开了一种细菌与细胞粘附的快速检测方法及其应用。所述快速检测方法其检测步骤如下：S1.培养细胞，形成单层细胞；S2.培养细菌，并加入荧光染料CFSE标记细菌，标记30min～60min后加入终止剂终止反应；细胞与荧光染料标记后的细菌以数量比1：300～400共培养2.5h～3h，再洗除未粘附的细菌；然后检测细胞的荧光强度，并计算粘附率；其中，细菌为可粘附但不入侵动物细胞的细菌，细胞为能贴壁生长的动物细胞。该专利技术所述的快速检测方法适用于细菌对宿主细胞粘附率的检测，在体外粘附试验模型的基础上，采用CFSE荧光染料标记细菌，通过检测细胞的荧光强度，即可得知细胞上细菌的粘附率。然而，该专利技术方法不适用于多种细菌同时粘附细胞的检测，无法为预防某些病原菌侵染疾病的发生提供依据。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种细菌粘附细胞的快速检测方法，通过将有益菌和病原菌同时粘附细胞，探索有益菌对病原菌的抗粘附影响，为预防某些病原菌侵染疾病的发生提供了简单、快速、有效的依据。本专利技术为实现上述目的所采取的技术方案为：一种细菌粘附细胞的快速检测方法，包括细胞培养、细菌培养和细菌粘附，具体包括如下步骤：S1.培养细胞，形成单层细胞；S2.分别培养有益菌和病原菌，并加入荧光染料CFSE标记各种细菌，标记30-60min后加入终止剂终止反应；S3.将细胞与荧光染料标记后的有益菌和病原菌共培养，粘附0.1-1.5h后，洗除未粘附的细菌；然后检测细胞的荧光强度，并计算粘附率。作为优选，步骤S2中有益菌培养用培养基含有培养基重量0.01-0.1％的1,2:4,5-二-O-异亚丙基-D-呋喃核酮糖和0.002-0.005％的芸苔素，1,2:4,5-二-O-异亚丙基-D-呋喃核酮糖和芸苔素的特殊存在，能够促进有益菌进行生长代谢，尤其是促进有益菌产生更多具有抗病原微生物活性的产物，如有机酸(乳酸、乙酸等)、过氧化氢、细菌素等，这些活性代谢产物具有良好的抑菌杀菌性能，可对病原菌起到一定的抗菌效果，从而抑制病原菌对细胞的粘附；同时，能够在一定程度上稳定抗菌物质的活性，延长抗菌作用时间，使得当有益菌和病原菌共同粘附时，有益菌具有长效的竞争优势从而抑制病原菌发挥作用。作为优选，步骤S2中CFSE的浓度为120-150μM。作为优选，步骤S2中进行荧光标记的细菌密度为107-108CFU/mL。作为优选，步骤S2中CFSE与细菌菌液体积比为2.5-3:1。作为优选，步骤S2中细菌荧光标记的时间为25-35min。作为优选，步骤S2中的终止剂为含20-50％胎牛血清的完全培养基。作为优选，步骤S3粘附过程中，将有益菌和病原菌同时加入受体细胞，再加入有益菌体积分数为0.03-0.06％的N-苄氧羰基甘氨酸和0.001-0.003％的质粒DNA，N-苄氧羰基甘氨酸和质粒DNA具有协同作用，其一能够加速细菌粘附达到饱和的时间，从而加快后续检测步骤的进行；其二有利于改善有益菌的粘附适应性，使得有益菌一方面粘附受体细胞表面的特异性受体，一方面与病原菌表面的非特异性受体进行附着，最终使得有益菌在细胞表面形成一层生物屏障，构成有利的定植抗力，阻止病原菌的粘附和定植，保护了细胞不受病原菌的侵害。本专利技术的有益效果为：1)本专利技术检测方法中省去了细胞裂解的过程，减少了因细胞未完全裂解而产生的误差；省去了菌落计数的过程，减少了因菌落计数产生的误差；直接通过荧光检测即可快速获得检测结果，检测的过程简单、快速，且耗费的时间不到传统方法的一半；2)本专利技术通过将有益菌和病原菌同时粘附细胞，探索有益菌对病原菌的抗粘附影响；其影响因素包括，有益菌通过对病原菌粘附从而降低病原菌对细胞的粘附侵害，同时有益菌可分泌乳酸和某些蛋白质类的抗菌物质将病原菌杀死，从而宏观上表现为动物疾病减少，生长、发育加快；在实际生产应用中，本专利技术检测方法为有益菌对细胞进行保护提供了依据。本专利技术采用了上述技术方案提供范文，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。具体实施方式下面分别以埃希氏大肠杆菌和嗜热链球菌结合实施例对本专利技术作进一步详细描述：本专利技术实施例采用受体细胞为Caco-2细胞，有益菌选用嗜酸乳杆菌和两歧双歧杆菌，病原菌选用大肠杆菌K88和猪霍乱沙门氏菌。实施例1：一种细菌粘附细胞的快速检测方法，包括细胞培养、细菌培养和细菌粘附，具体包括如下步骤：(1)将Caco-2细胞生长在10％灭活(30min，56℃)胎牛血清、终浓度为100U/mL的含100g/L青、链霉素的DMEM(含25mmol/L葡萄糖)培养基中，在37℃、5％CO2培养箱中培养；粘附试验所用Caco-2细胞接种于24孔培养板，密度为1.4×104个/孔，在37℃、5％CO2培养箱中培养，每隔1d更换1次培养基；细胞在融合后使用；(2)各细菌用液体培养基：嗜酸乳杆菌生长在MRS肉汤培养基中，两歧双歧杆菌生长在加入少许L-盐酸半胱氨酸的MRS培养基中，在5％CO2厌氧培养箱中37℃培养48h；大肠杆菌K88、猪霍乱沙门氏菌培养在MH肉汤中，37℃培养10h；培养完毕后，4000r/min离心10min，收集细菌，用Hank's液洗2次，最后用DMEM培养液悬浮细菌，调整细菌浓度为107-108CFU/mL，备用；上述有益菌培养基中还含有培养基重量0.06％的1,2:4,5-二-O-异亚丙基-D-呋喃核酮糖和0.002％的芸苔素，1,2:4,5-二-O-异亚丙基-D-呋喃核酮糖和芸苔素的特殊存在，能够促进有益菌进行生长代谢，尤其是促进有益菌产生更多具有抗病原微生物活性的产物，如有机酸(乳酸、乙酸等)、过氧化氢、细菌素等，这些活性代谢产物具有良好的抑菌杀菌性能，可对病原菌起到一定的抗菌效果，从而抑制病原菌对细胞的粘附；同时，能够在一定程度上稳定抗菌物质的活性，延长抗菌作用时间，使得当有益菌和病原菌共同粘附时，有益菌具有长效的竞争优势从而抑制病原菌发挥作用；荧光染料标记方法为：称取一定量的CFSE粉末，加DMSO溶解，配制成浓度为135μM的CFSE溶液，取2.5mLCFSE溶液小心加入到上述收集有细菌(1mL)的离心管内，轻轻吹打本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细菌粘附细胞的快速检测方法，其特征在于：将荧光染料标记后的有益菌和病原菌同时粘附细胞；所述粘附过程为：将有益菌、病原菌以及N‑苄氧羰基甘氨酸和质粒DNA同时加入受体细胞，共培养进行粘附。

【技术特征摘要】
1.一种细菌粘附细胞的快速检测方法，其特征在于：将荧光染料标记后的有益菌和病原菌同时粘附细胞；所述粘附过程为：将有益菌、病原菌以及N-苄氧羰基甘氨酸和质粒DNA同时加入受体细胞，共培养进行粘附。2.根据权利要求1所述的一种细菌粘附细胞的快速检测方法，其特征在于：所述N-苄氧羰基甘氨酸和质粒DNA的加入量分别为有益菌体积分数的0.03-0.06%和0.001-0.003%。3.根据权利要求1所述的一种细菌粘附细胞的快速检测方法，其特征在于：所述检测方法包括如下步骤：S1.培养细胞，形成单层细胞；S2.分别培养有益菌和病原菌，并加入荧光染料CFSE标记各种细菌，标记30-60min后加入终止剂终止反应；S3.将细胞与荧光染料标记后的细菌共培养，粘附0.1-1.5h后，洗除未粘附的细菌；检测细胞的荧光强度，并计算粘附率。4.根据权利要求3所述的一种细菌粘附细胞的快速检测方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾小敏，
申请(专利权)人：曾小敏，
类型：发明
国别省市：贵州,52