The present invention relates to the application of Annexin A2, a membrane protein on Thp_1 cells, in the induction of apoptosis of Angiostrongylus Cantonensis (Ac) protein Galectin_1. The present invention relates to the application of Annexin A2 on Thp_1 cell membrane protein in apoptosis induction of Angiostrongylus cantonensis protein Galectin_1. The application of Annexin A2 in studying the pathogenic mechanism of Angiostrongylus cantonensis and the application of prevention and treatment provides theoretical basis for the treatment of Angiostrongylus cantonensis disease, and provides a potential target for the development of therapeutic drugs, namely Annexin A2, at the same time for Angiostrongylus cantonensis disease The research and development of therapeutic drugs lay a foundation for the individualized treatment of Angiostrongylus cantonensis, which has considerable market prospects and applicability.
【技术实现步骤摘要】
Thp-1细胞膜蛋白AnnexinA2在Ac-Gal-1诱导凋亡中的应用
本专利技术属于生命科学
，尤其是一种Thp-1细胞上的膜蛋白AnnexinA2在广州管圆线虫(AngiostrongylusCantonensis，Ac)蛋白Galectin-1诱导凋亡中的应用。
技术介绍
广州管圆线虫(AngiostrongylusCantonensis)是引起嗜酸性脑膜炎的重要病原体，可引起中枢神经系统损伤，严重者导致死亡。Galectins在诱导细胞凋亡方面发挥重要作用，但尚无广州管圆线虫Galectin-1具有诱导细胞凋亡功能的研究和应用，以及诱导细胞凋亡的膜蛋白受体。通过检索，与本专利技术专利申请相似的现有研究如下：(1)人类Galectins蛋白具有诱导细胞凋亡的功能。(2)广州管圆线虫Galectin-1是一种重要的免疫调节分子，具有免疫抑制作用。通过对比，本专利技术专利申请与上述相关的公开文献存在本质的不同。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处，补充对广州管圆线虫致病机制研究的不足，提供一种Thp-1细胞上的膜蛋白AnnexinA2在...
【技术保护点】
1.一种Thp‑1细胞上的膜蛋白Annexin A2在广州管圆线虫蛋白Galectin‑1诱导凋亡中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种Thp-1细胞上的膜蛋白AnnexinA2在广州管圆线虫蛋白Galectin-1诱导凋亡中的应用。2.根据权利要求1所述的Thp-1细胞上的膜蛋白AnnexinA2在广州管圆线虫蛋白Galectin-1诱导凋亡中的应用，其特征在于：所述应用为广州管圆线虫蛋白Galectin-1通过细胞膜蛋白AnnexinA2诱导Thp-1细胞凋亡的应用。3.根据权利要求1所述的Thp-1细胞上的膜蛋白AnnexinA2在广州管圆线虫蛋白Galectin-1诱导凋亡中的应用，其特征在于：所述应用为广州管圆线虫蛋白Galectin-1在诱导细胞凋亡以及广州管圆线虫致病机制中的应用。4.根据权利要求1所述的Thp-1细胞上的膜蛋白AnnexinA2在广州管圆线虫蛋白Galectin-1诱导凋亡中的应用，其特征在于：所述应用为Thp-1细胞上的膜蛋白AnnexinA2在广州管圆线虫蛋白Galectin-1诱导的细胞凋亡中作为治疗广州管圆线虫的药物靶点中的应用。5.根据权利要求1至4任一项所述的Thp-1细胞上的膜蛋白AnnexinA2在广州管圆线虫蛋白Galectin-1诱导凋亡中的应用，其特征在于：所述广州管圆线虫蛋白Galectin-1具有通过结合Thp-1细胞膜上的膜蛋白AnnexinA2诱导细胞凋亡的作用。6.根据权利要求5所述的Thp-1细胞上的膜蛋白AnnexinA2在广州管圆线虫蛋白Galectin-1诱导凋亡中的应用，其特征在于：所述广州管圆线虫蛋白Galectin-1具有通过结合Thp-1细胞膜上的膜蛋白AnnexinA2诱导细胞凋亡的作用的验证方法，步骤如下：⑴广州管圆线虫Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡——CCK-8实验CCK-8实验分别检测不同作用时间：6h，12h，18h，24h，不同浓度0-100μMAc-Galectinl-1蛋白对Thp-1细胞的抑制情况，所述Ac-Galectinl-1蛋白为广州管圆线虫蛋白Galectin-1；具体操作步骤如下：①Thp-1细胞毒性实验：每孔加入100微升5000±10个细胞。按照实验需要，进行培养并给予0，0.05，0.2，0.8，3.2，12.5，25，50，100μg/mLAc-Galectin-1刺激，作用6h、12h、18h、24h；②每孔加入10微升CCK-8溶液，同时设置加入相应量细胞培养液、Ac-Galectin-1和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照；③在细胞培养箱内继续孵育2h；④在450nm处测定吸光度；⑵广州管圆线虫Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡——AnnexinⅤ-FITC流式方法检测细胞凋亡为了验证广州管圆线虫Galectin-1诱导THP-1细胞凋亡，采用AnnexinV-FITC/PI双染色结合流式细胞术检测THP-1细胞凋亡；根据CCK-8结果，选择500ng/mL、1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mLAc-Galectin-1蛋白作用浓度，进行流式检测；同等浓度的牛血清白蛋白处理Thp-1细胞作为无关蛋白对照，地塞米松处理Thp-1细胞作为细胞凋亡的阳性对照；与BSA对照组相比，Ac-Galectin-1处理组细胞凋亡率显著增高；具体操作步骤如下：①将0.5μg/mL、1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mLAc-Galectin-1加入到Thp-1细胞，作用18h后，37℃预温的PBS洗涤细胞一次，将Thp-1细胞用胰酶消化下来；②细胞消化下来后，加入细胞培养液转移到15mL离心管内，2000g离心5min，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数；③取1～5×105重悬的细胞，2000g离心5min，弃上清，加入500μL结合液，轻轻重悬细胞；④加入5μL结合液，轻轻混匀；再加入5μL碘化丙啶PI，轻轻混匀；⑤室温20～25℃避光孵育10min；⑥随即进行流式细胞仪检测，结合液为绿色荧光，PI为红色荧光；⑶广州管圆线虫Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡——WesternBlot检测凋亡蛋白的表达为了进一步验证Ac-Galectin-1诱导Thp-1凋亡，WesternBlot检测促凋亡蛋白caspase-3、Bax、caspase-9蛋白及抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达量；分为正常细胞组、Ac-Galectin-1处理组、同等浓度的牛血清白蛋白处理组作为无关蛋白对照；与正常细胞组和同等浓度的牛血清白蛋白处理组相比，Ac-Galectin-1处理组细胞促凋亡蛋白caspase-3、Bax、caspase-9蛋白表达量显著增高，抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达量显著降低；具体步骤如下：①样品制备100μg/mLAc-Galectin-1作用于Thp-1细胞，弃去培养液，加入PBS后用刮铲刮下贴壁细胞细胞，2000rpm离心5min，收集细胞，PBS洗涤一次；每107个细胞加50μL细胞裂解液，冰上裂解l0min后，13000rpm/min离心l0min，收集上清，取40μL，加入10μL的5×蛋白上样缓冲液，煮沸l0min制各样品；②SDS—PAGE电泳；③转膜：依次按照滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸自上而下的顺序放置于半干转仪中，用玻璃棒将气泡赶尽，电压15V，转膜30min；④封闭：转膜结束后将PVDF膜用质量浓度为5％的脱脂牛奶室温封闭2h，然后用TBST洗涤3次，每次10mim；⑤孵育一抗：将一抗抗体用质量浓度为5％的脱脂牛奶按体积比1:1000稀释，室温孵育2h；然后用TBST洗涤3次，每次10min；⑥孵育二抗：HRP标记的山羊抗小鼠或抗兔IgG二抗用质量浓度为5％的脱脂牛奶按体积比1:5000稀释，室温孵育1h；然后用TBST洗涤5次，每次10min；⑦曝光：洗涤完毕后，孵育发光液2min后进行曝光，成像仪成像，观察结果；⑷广州管圆线虫Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡——caspase-3活性检测Caspase-3是细胞凋亡的执行分子，其发生活化引起细胞凋亡；为了进一步验证Ac-Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡，检测caspase-3的酶活性；Ac-Galectin-1引起caspase-3酶活性增高，则引起Thp-1细胞发生凋亡；操作步骤如下：①测定pNA标准曲线：标准品稀释液的配制：按照每0.9mL检测缓冲液加入0.1mL裂解液的比例配制标准品稀释液；将pNA10mM用标准品稀释液稀释为0、10、20、50、100、200μM，每个浓度取100μL用酶标仪进行检测，测定A405；每一个标准品的A405减去不含pNA的空白对照的A405计算出实际的吸光度，并制作出pNA浓度相对于A405的标准曲线；②样品的收集吸取细胞培养液，用胰酶消化贴壁细胞，收集细胞加入到新的细胞培养液中，600×g4℃离心5min收集细胞，小心吸去上清，PBS洗涤一次，再次吸尽上清后，按照每200万细胞加入100μL裂解液的比例加入细胞裂解液，重悬细胞沉淀，放置冰上裂解15min；③样品测定如下设置反应体系：空白对照:检测缓冲液40μL、待测样品0μL、裂解液50μL、Ac-DEVD-pNA(2mM)10μL样品：检测缓冲液40μL、待测样品50μL、裂解液0μL、Ac-DEVD-pNA(2mM)10μL取出Ac-DEVD-pNA(2mM)，置于冰浴上备用；在比色杯中加入Ac-DEVD-pNA(2mM)后混匀，在混匀时注意避免产生气泡，37℃孵育1-2h，样品的A405减去空白对照的A405，即为样品中caspase-3催化产生的pNA产生的吸光度；⑸Ac-Galectin-1与Thp-1细胞膜上AnnexinA2相互作用——提取Thp-1细胞膜蛋白①通过4℃、700×g离心5min，收集细胞1±0.1g湿重，细胞个数为0.2-10×108，对于贴壁细胞，刮下PBS中的细胞，然后700×g离心5min，沉淀细胞；②用3mL冰冷的PBS清洗细胞一次；③将细胞重新悬浮在2mLHomogenizationBuffer中，在冰上用匀浆细胞30-50次；④将匀浆转移到1.5mL微量离心管中，在4℃条件下，700×g离心10min，收集上清液并弃去沉淀；⑤将上清液转移至新的离心管中，并在4℃以10000×g离心30min；⑥弃上清，收集白色沉淀，白色沉淀是总细胞膜蛋白质，其含有来自质膜和细胞器的蛋白质膜；⑦纯化细胞膜蛋白质，获得质膜蛋白；⑹Ac-Galectin-1与Thp-1细胞膜上AnnexinA2相互作用——IP实验为了探究与Ac-Galectin-1相互结合的THP-1细胞膜表面受体蛋白，采用IP方法沉淀互作蛋白；操作步骤如下：①贴壁细胞裂解液的制备弃去培养基，用预冷的PBS清洗细胞两次，保持于冰上，再次加入PBS并用细胞刮铲刮取细胞，收集细胞并转移至15mL离心管中；向收集好的细胞中加入1mL细胞裂解Buffer于冰上孵肓10‐30min，中间晃动使裂解Buffer和细胞充分接触；4℃，12000×g离心10min，收集上清，并转移至新的离心管-20℃保存，备用；②取细胞裂解液350μL加入350μL2×IPBuffer；③将样品加入到His标签蛋白磁珠复合物中，室温孵育10min；④孵育完成后将离心管放入磁力架1min，弃去上清；⑤用300μL1×Binding/WashBuffer清洗磁珠4次，加入1×Binding/WashBuffer后混匀放入磁力架1min后弃去上清，收集磁珠‐His标签-蛋白-未知蛋白复合物；⑥向上述磁珠中，加入100μLHis标签洗脱液室温孵育混悬5min；⑦将离心管放入磁力架，收集上清放入新的离心管，上清中的His标签蛋白和未知蛋白复合物可用于后续分析；⑧取50μL收集的His标签蛋白和未知蛋白复合物，进行SDS‐PAGE电泳，考马斯亮蓝R250染色，观察电泳结果；⑨将His标签蛋白和未知蛋白复合物液体以及跑胶凝胶条送去蛋白质谱检测，采用QE质谱鉴定；⑺Ac-Galectin-1与Thp-1细胞膜上AnnexinA2相互作用——免疫荧光荧光共定位初步验证IP及QE质谱结果，即Ac-Galectin-1与AnnexinA2可能存在相互作用：①将圆形细胞爬片加到24孔板；...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄慧聪，闫宝龙，史晓萌，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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