稳定化的融合前RSV F蛋白制造技术

本发明专利技术提供了稳定的融合前呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白、包含所述蛋白的免疫原性组合物以及其用于预防和/或治疗RSV感染的用途。

Stabilized pre-fusion RSV F protein

The present invention provides a stable pre-fusion respiratory syncytial virus (RSV) F protein, an immunogenic composition containing the protein, and its use for preventing and/or treating RSV infection.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】稳定化的融合前RSVF蛋白本专利技术涉及医学领域。本专利技术特别涉及重组的融合前RSVF蛋白、涉及编码这些RSVF蛋白的核酸分子、以及其例如在疫苗中的用途。
技术介绍
在20世纪50年代发现呼吸道合胞病毒(RSV)后，该病毒很快成为人类中与下呼吸道感染和上呼吸道感染相关的公认的病原体。据估计，全世界每年有6400万RSV感染，导致16万人死亡(世界卫生组织急性呼吸道感染(WHOAcuteRespiratoryInfections)2009年9月更新)。最严重的疾病尤其发生在早产儿、老年人和免疫受损的个体中。在2岁以下的儿童中，RSV是最常见的呼吸道病原体，占因呼吸道感染而住院的约50％，并且住院高峰发生在2-4月龄。据报道，几乎所有儿童到2岁时都被RSV感染过。终身重复感染归因于无效的自然免疫力。在老年人中，RSV疾病负担与由非大流行性A型流感感染引起的那些相似。RSV是一种属于肺病毒亚科的副粘病毒。它的基因组编码各种蛋白质，包括称为RSV糖蛋白(G)和RSV融合蛋白(F)的膜蛋白，它们是用于中和抗体的主要抗原靶标。对抗F1蛋白的融合介导部分的抗体可以预防细胞中的病毒吸收，并且因此具有中和作用。RSVF通过从不稳定的融合前构象融合到稳定的融合后构象的不可逆的蛋白质重折叠，将病毒和宿主细胞膜融合。已经确定了RSVF(McLellanJS.等人Science[科学]342,592-598(2013)；McLellanJS,等人NatStructMolBiol[自然结构与分子生物学]17,248-250(2010)；McLellanJS.等人,Science[科学]340,1113-1117(2013)；SwansonKA等人ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica[美国国家学院院刊]108,9619-9624(2011))，和来自相关的副粘病毒的融合蛋白的两种构象结构，提供了对这种复杂的融合机器的机制的深刻理解。与其他I类型融合蛋白一样，无活性前体(RSVF0)需要在细胞内成熟过程中通过弗林蛋白酶样蛋白酶进行切割。RSVF含有两个弗林蛋白酶位点，这导致三个蛋白：F2、p27和F1，其中后者在其N-末端含有疏水性融合肽(FP)。为了从融合前构象重折叠成融合后构象，在残基137和216之间的包括FP和七肽重复区A(HRA)的重折叠区域1(RR1)必须从螺旋、环和链的组装转化成长的连续螺旋。然后，位于RR1的N-末端片段的FP能够远离病毒膜延伸并插入到靶细胞的近侧膜中。接下来，在融合前F刺突中形成C-末端茎并包括七肽重复区B(HRB)的重叠区域2(RR2)重新定位到RSVF的头部的另一侧并且将HRA卷曲螺旋三聚体与HRB结构域结合以形成六螺旋束。RR1卷曲螺旋的形成和RR2的重新定位以完成六螺旋束是在重折叠过程中发生的最显著的结构变化。当前不存在对抗RSV感染的疫苗，但是由于疾病负担高，其是被希望的。RSV融合糖蛋白(RSVF)是一种引人注目的疫苗抗原，它是中和人类血清中抗体的主要靶标。人类血清中的大多数中和抗体是对抗融合前构象，但是由于它的不稳定性，融合前构象具有在溶液中和病毒粒子表面上过早重折叠成融合后构象的倾向。如上所述，晶体结构揭示了融合前状态和融合后状态之间的大的构象变化。重排的程度表明，只有一部分针对RSV-F融合后构象的抗体能够与病毒表面上的融合前刺突的天然构象发生交叉反应。因此，产生对抗RSV的疫苗的努力集中于开发含有RSVF蛋白的融合前形式的疫苗(参见例如WO20101149745、WO2010/1149743、WO2009/1079796、WO2012/158613)。然而，这些努力尚未产生可用于人类测试的候选物稳定的融合前RSVF蛋白。因此，仍然需要有效的对抗RSV的疫苗，特别是包含处于融合前构象的RSVF蛋白的疫苗。本专利技术的目的是提供此类稳定的融合前RSVF蛋白，以安全和有效的方式用于接种对抗RSV的疫苗。
技术实现思路
本专利技术提供了稳定的、重组的、融合前呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)蛋白(即稳定化处于融合前构象的重组RSVF蛋白)及其片段。RSVF蛋白、或其片段包含至少一个对融合前构象F蛋白具有特异性的表位。在某些实施例中，融合前RSVF蛋白是可溶性蛋白。在某些实施例中，RSVF蛋白是三聚体。在某些实施例中，RSVF蛋白是三聚体RSVF蛋白的多聚体。本专利技术还提供了编码融合前RSVF蛋白或其片段的核酸分子，以及包含此类核酸分子的载体。本专利技术还涉及组合物，优选地免疫原性组合物，这些组合物包含RSVF蛋白、核酸分子和/或载体，并且涉及其在诱导对抗RSVF蛋白的免疫应答中的用途，特别是其作为疫苗的用途。本专利技术还涉及用于在受试者中诱导抗呼吸道合胞病毒(RSV)免疫应答的方法，这些方法包括给予受试者有效量的融合前RSVF蛋白、编码所述RSVF蛋白的核酸分子、和/或包含所述核酸分子的载体。优选地，诱导免疫应答的特征在于对抗RSV的中和抗体和/或对抗RSV的保护性免疫。在具体的方面中，本专利技术涉及一种用于在受试者中诱导抗呼吸道合胞病毒(RSV)F抗体的方法，该方法包括给予受试者有效量的包含融合前RSVF蛋白、编码所述RSVF蛋白的核酸分子、和/或包含所述核酸分子的载体的免疫原性组合物。附图说明图1：具有突变N67I、S215P、T357K、N371Y和D486N的蛋白F的纯化。来自离子交换柱的洗脱液的Superdex200凝胶过滤色谱图。箭头指示收集峰。图2：A)在还原(R)和非还原(NR)下，含有来自SEC色谱图的峰的FN67I、S215P、T357K、N371Y、D486N蛋白样品的SDS-PAGE分析。将凝胶用考马斯亮蓝染色。图3：纯化的RSVF蛋白FN67I、S215P、T357K、N371Y、D486N的蛋白质浓度通过用CR9501和CR9503单克隆抗体的QOctet测定来测量。CR9501仅与处于融合前构象的RSVF结合。CR9503与处于融合前构象和融合后构象两者的RSVF结合。绘制为平均值±SE。图4：RSVF蛋白FN67I、S215P、T357K、N371Y、D486N的温度稳定性。用SyproOrange荧光染料通过差式扫描荧光测定法(DSF)测量解链温度(Tm℃)。T357K和N371Y取代的引入使PRPM的Tm增加了3.5度到68.5度。具体实施方式呼吸道合胞病毒(RSV)的融合蛋白(F)参与了病毒膜与感染所需的宿主细胞膜的融合。将RSVFmRNA翻译成被称为F0的574个氨基酸前体蛋白，该前体蛋白在N-末端含有信号肽序列(例如，SEQIDNO:13的氨基酸残基1-26)，该信号肽序列在内质网中被信号肽酶去除。F0在两个位点(在氨基酸残基109/110和136/137之间)处被细胞蛋白酶(特别是弗林蛋白酶，或弗林蛋白酶样)切割，去除短的糖基化间插序列(也称为p27区域)，包含氨基酸残基110至136，并产生被称为F1和F2的两个结构域或亚基。F1结构域(氨基酸残基137-574)在其N-末端含有疏水性融合肽，并且C-末端含有跨膜(TM)(氨基酸残基530-550)和胞质区域(氨基酸残基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组的融合前呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)蛋白，其包含与在位置357上的氨基酸的突变和在位置371上的氨基酸的突变组合的在位置215上的氨基酸残基的突变。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.05.30 EP 16172008.11.一种重组的融合前呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)蛋白，其包含与在位置357上的氨基酸的突变和在位置371上的氨基酸的突变组合的在位置215上的氨基酸残基的突变。2.根据权利要求1所述的融合前RSVF蛋白，其包含在位置215上的氨基酸S到P(S215P)的突变、在位置357上的氨基酸T到K(T357K)的突变和在位置371上的氨基酸N到Y(N371Y)的突变。3.根据权利要求1或2所述的融合前RSVF蛋白，其进一步包含选自下组的至少一个突变，该组由以下组成：(a)在位置67上的氨基酸残基的突变；和(b)在位置486上的氨基酸残基的突变。4.根据权利要求3所述的融合前RSVF蛋白，其中另外的该至少一个突变选自下组，该组由以下组成：(a)在位置67上的氨基酸残基N/T到I的突变；和(b)在位置486上的氨基酸残基D到N的突变。5.根据前述权利要求中任一项所述的融合前RSVF蛋白，其中该蛋白包含至少一个对融合前构象F蛋白具有特异性的表位，其中该至少一个表位被融合前特异性单克隆抗体识别，该融合前特异性单克隆抗体包含SEQIDNO:1的重链CDR1区域、SEQIDNO:2的重链CDR2区域、SEQIDNO:3的重链CDR3区域和SEQIDNO:4的轻链CDR1区域、SEQIDNO:5的轻链CDR2区域、和SEQIDNO:6的轻链CDR3区域，和/或该融合前特异性单克隆抗体包含SEQIDNO:7的重链CDR1区域、SEQIDNO:8的重链CDR2区域、SEQIDNO:9的重链CDR3区域和SEQIDNO:10的轻链CDR1区域、SEQIDNO:67的轻链CDR2区域、和SEQIDNO:...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·P·M·朗格戴克，
申请(专利权)人：扬森疫苗与预防公司，
类型：发明
国别省市：荷兰,NL