基于Nrdp1基因RNAi和miR-494的免疫脂质体及其应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种基于Nrdp1基因RNAi和miR‑494的免疫脂质体及其应用。本发明专利技术的脂质体包封有miR‑494和Nrdp1基因的RNAi的重组质粒，并与抗F4/80单克隆抗体共价结合而成。其制备方法包括miR‑494和Nrdp1基因的RNAi表达载体的制备、miR‑494和Nrdp1基因的RNAi重组真核表达载体的脂质体包封、包封有miR‑494和Nrdp1基因的RNAi的脂质体与抗F4/80单克隆抗体的连接共3个步骤。本发明专利技术的免疫脂质体可以主动靶向小胶质细胞，在细胞中释放出并表达miR‑494和Nrdp1基因的RNAi，抑制Nrdp1的表达，从而发挥抗炎症的作用，具有高效、低毒、制备方法简单等优点，可用于制备抗炎症的药物，在抑制脑出血继发炎症反应方面具有良好的应用前景。

Immunoliposomes based on Nrdp1 gene RNAi and microRNA-494 and their applications

The invention belongs to the field of genetic engineering, in particular to an immune liposome based on Nrdp1 gene RNAi and microRNA 494 and its application. The liposome of the present invention encapsulates the recombinant plasmid of RNAi containing the genes of Mir 494 and Nrdp1, and covalently combines with anti-F4/80 monoclonal antibody. The preparation method includes three steps: preparation of RNAi expression vectors of microRNA494 and Nrdp1 genes, liposome encapsulation of RNAi recombinant eukaryotic expression vectors of microRNA494 and Nrdp1 genes, and conjugation of RNAi encapsulated with microRNA494 and Nrdp1 genes with anti-F4/80 monoclonal antibodies. The immune liposome of the invention can actively target microglia, release and express RNAi of the genes of microglia 494 and Nrdp1 in the cells, inhibit the expression of Nrdp1, thereby playing an anti-inflammatory role, has the advantages of high efficiency, low toxicity, simple preparation method, etc. It can be used to prepare anti-inflammatory drugs, and has a good application prospect in inhibiting the secondary inflammation reaction of cerebral hemorrhage.

【技术实现步骤摘要】
基于Nrdp1基因RNAi和miR-494的免疫脂质体及其应用
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种基于Nrdp1基因RNAi和miR-494的免疫脂质体及其应用。
技术介绍
脑出血(cerebralhemorrhage)是指非外伤性脑实质内血管破裂引起的出血，占全部脑卒中的20％～30％，急性期病死率为30％～40％。发生的原因主要与脑血管的病变有关，即与高血脂、糖尿病、高血压、血管的老化、吸烟等密切相关。脑出血的患者往往由于情绪激动、费劲用力时突然发病，早期死亡率很高，幸存者中多数留有不同程度的运动障碍、认知障碍、言语吞咽障碍等后遗症。目前治疗脑出血的药物无一具有突破性的治疗效果，尤其是继发性脑损伤导致的神经功能缺失未得到根本解决。减轻出血后继发性脑损伤,营救神经元仍然是治疗的目标，而更好的理解脑出血的病理生理机制无疑是提高临床疗效的有效途径。目前临床有关脑出血的认识上，注重血肿的压迫效应，治疗上也强调血肿的清除和促进血肿的吸收。但这些治疗措施并没能有效的降低脑出血患者的死亡率和致残率。虽然现代医学研究也逐渐认识到脑出血后血管反应进而级联的炎症反应在脑微环境的破坏，进而神经细胞损伤的病理性过程中的作用，但是炎症反应并没有引起临床医生的重视,而且临床上也缺乏相应的治疗药物。因此，研制一种针对脑出血后炎症反应的药物是当务之急。小胶质细胞(microglia)是神经胶质细胞的一种，相当于脑和脊髓中的巨噬细胞，是中枢神经系统(CNS)中的第一道也是最主要的一道免疫防线。小胶质细胞大约占大脑中的神经胶质细胞的20％。小胶质细胞不停的清除着中枢神经系统中的损坏的神经，斑块及感染性物质。过多激活或失控的小胶质细胞会引起神经毒性。他们是促炎因子和氧化应激的重要来源，如肿瘤坏死因子(TNF)，一氧化氮，白介素等有神经毒性的物质。F4/80是小胶质细胞活化后特异表达的标志，可以作为分子靶向性标志。免疫脂质体的靶向治疗技术是通过将载药脂质体与单克隆抗体或基因抗体供价结合成免疫脂质体，借助抗体与靶细胞表面抗原或受体结合的作用，经接触释放、吸附、吞噬、吞饮及融合等方式，释放出包封的药物，来特异性的杀伤靶细胞，而达到治疗的目的的技术。因此开发一种基于Nrdp1RNAi和miR-494的免疫脂质体，其可用于制备抗炎症的药物，在抑制脑出血继发炎症反应方面具有良好的应用前景。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种基于Nrdp1RNAi和miR-494的核苷酸片段。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：一种基于Nrdp1基因的RNAi和miR-494的核苷酸片段，其核苷酸序列为SEQIDNO:1所示。其中miR-494即为微小RNA-494。经过筛选，Nrdp1基因的有效RNAi片段为5’-TTAAATTTTAGTTATCTAAAATAAAAGATGG-3’。将上述核苷酸片段借助其他手段在细胞中表达后，可增加细胞中miR-494的含量，并抑制Nrdp1表达和炎症启动过程。本专利技术的目的之二在于提供一种重组表达载体，所述重组表达载体表达的序列中包含目的一的核苷酸片段。即本专利技术的重组表达载体表达的片段中包含SEQIDNO:1所示核苷酸序列。作为优选的方案，所述重组表达载体为重组真核表达载体。即本专利技术的重组表达载体能够在真核生物的细胞中表达目的一的基于Nrdp1RNAi和miR-494的核苷酸片段。进一步优选为质粒载体pGenesil-1。本专利技术的目的之三在于提供一种包封有本专利技术的重组表达载体的脂质体。脂质体(liposome)是一种人工膜。在水中磷脂分子亲水头部插入水中，脂质体疏水尾部伸向空气，搅动后形成双层脂分子的球形脂质体，直径25～1000nm不等。脂质体可用于转基因，或制备的药物，利用脂质体可以和细胞膜融合的特点，将药物送入细胞内部。生物学定义:当两性分子如磷脂和鞘脂分散于水相时，分子的疏水尾部倾向于聚集在一起，避开水相，而亲水头部暴露在水相，形成具有双分子层结构的的封闭囊泡，称为脂质体。本专利技术的脂质体可以和细胞膜融合，将包封的本专利技术的重组表达载体送入细胞内。本专利技术的目的之四在于提供一种免疫脂质体，其由本专利技术的脂质体与抗体共价结合获得。根据目的细胞的不同，本专利技术的免疫脂质体结合有不同的抗体。优选的，上述抗体为单克隆抗体或基因抗体。进一步，当靶向的目的细胞为小胶质细胞时，所述抗体优选为抗F4/80单克隆抗体。本专利技术的基于miR-494和Nrdp1基因的RNAi免疫脂质体，由包封有miR-494和Nrdp1基因的RNAi重组真核表达载体的脂质体与抗F4/80单克隆抗体共价结合而成。进一步，所述miR-494和Nrdp1基因的RNAi重组真核表达载体是将核苷酸序列如SEQIDNo.1所示的miR-494和Nrdp1基因的RNAi基因插入真核表达载体pGenesil-1的多克隆位点中而得到；进一步，所述脂质体由氢化油脂和胆固醇脂组成。本专利技术的免疫脂质体可以主动靶向小胶质细胞，在细胞中释放出miR-494和Nrdp1基因的RNAi重组真核表达载体并表达miR-494和Nrdp1基因的RNAi，增加miR-494的含量，并抑制Nrdp1表达和炎症启动过程，从而发挥抗炎症的作用，具有高效、低毒等优点。本专利技术的目的还在于提供一种本专利技术的重组表达载体在用于制备抗炎症药物中的应用。本专利技术的重组表达载体借助其他手段进入受体细胞，可于受体细胞内表达基于Nrdp1基因的RNAi和miR-494的核苷酸片段，增加miR-494的含量，并抑制Nrdp1表达，进一步抑制炎症启动过程，从而发挥抗炎症的作用。优选的，上述抗炎症药物为抑制脑出血继发炎症的药物。本专利技术的目的还在于提供一种本专利技术的脂质体在用于制备抗炎症药物中的应用。本专利技术的脂质体可以和细胞的细胞膜融合，将包封的重组表达载体送入细胞内，并在细胞内表达基于Nrdp1基因的RNAi和miR-494的核苷酸片段，增加miR-494的含量，并抑制Nrdp1表达，进一步抑制炎症启动过程，从而发挥抗炎症的作用。优选的，上述抗炎症药物为抑制脑出血继发炎症的药物。本专利技术的目的还在于提供一种本专利技术的免疫脂质体在用于制备抗炎症药物中的应用。本专利技术的免疫脂质体可通过共价结合的抗体识别目的细胞，并和细胞的细胞膜融合，将包封的重组表达载体送入细胞内，并在细胞内表达基于Nrdp1基因的RNAi和miR-494的核苷酸片段，从而发挥抗炎症的作用。优选的，上述抗炎症药物为抑制脑出血继发炎症的药物。本专利技术的目的还在于提供一种抑制脑出血继发炎症的药物，所述药物包含本专利技术的免疫脂质体以及赋予它的药学上可接受的载体。本专利技术的目的还在于提供一种本专利技术的免疫脂质体的构建方法，其方法简单，成功率高。其中，本专利技术的重组真核表达载体的构建方法，包括以下步骤：1)合成SEQIDNO:1所示核苷酸序列，设计如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示的序列作为引物，克隆获得目的DNA；2)步骤1)的目的DNA与质粒载体pGenesil-1连接后转化入大肠杆菌，筛选阳性克隆并提取质粒进行测序鉴定，测序结果包含如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的质粒即为pGenesil-1-miR-494/Nrdp1RNAi质粒。重组质粒大量生产时，将上述含本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于Nrdp1基因的RNAi和miR‑494的核苷酸片段，其特征在于，所述核苷酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.基于Nrdp1基因的RNAi和miR-494的核苷酸片段，其特征在于，所述核苷酸片段的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体表达的序列中包含权利要求1所述核苷酸片段。3.包封有权利要求2所述重组表达载体的脂质体。4.免疫脂质体，其特征在于，所述免疫脂质体由权利要求3所述的脂质体与抗体共价结合。5.根据权利要求4所述的免疫脂质体，其特征在于，靶向小胶质细胞时，所述抗体为抗F4/80单克隆抗体。6.权利要求2所述重组表达载体在用于制备抗炎症药物中的应用。7.权利要求3所述脂质体在用于制备抗炎症药物中的应用。8.权利要求4或5所述的免疫脂质体在用于制备抗炎症药物中的应用。9.一种抑制脑出血继发炎症的药物，其特征在于，所述药物包含权利要求4或5所述的免疫脂质体以及赋予它的药学上可接受的载体。10.一种权利要求4所述免疫脂质体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)克隆：合成SEQIDNO:1所示核苷酸序列，设计如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示的序列作为引物，克隆获得目的DNA；2)构建重组载体：步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯桂波，
申请(专利权)人：重庆医科大学附属永川医院，
类型：发明
国别省市：重庆,50