一种与鸡精子活力和受精率相关的miRNA及其应用制造技术

本发明专利技术涉及分子标记领域，具体提供一种与鸡精子活力和受精率相关的miRNA及其应用。本发明专利技术利用高通量测序技术和miRNA‑mRNA联合分析，筛选到调控鸡精子活力性状相关的miRNA，所述miRNA为gga‑miR‑7480‑5p，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述miRNA可以作为与鸡精子活力和受精率相关的分子标记，在鸡精子活力性状的选育提高中具有重要的实际应用价值。

A MicroRNAs Related to Chicken Sperm Vitality and Fertilization Rate and Its Application

The invention relates to the field of molecular markers, in particular to a microRNA related to chicken sperm motility and fertilization rate and its application. The invention utilizes high-throughput sequencing technology and combined analysis of microRNAs and RNA to screen microRNAs related to regulating chicken sperm motility traits. The microRNAs are GGA microRNAs 7480 5p, and their nucleotide sequences are shown as SEQ ID NO: 1. The microRNAs can be used as molecular markers related to chicken sperm motility and fertilization rate, and have important practical application value in improving chicken sperm motility Traits Selection and breeding. Value.

【技术实现步骤摘要】
一种与鸡精子活力和受精率相关的miRNA及其应用
本专利技术涉及分子标记领域，具体涉及一种与鸡精子活力和受精率相关的miRNA及其应用。
技术介绍
精子活力(spermmotility)是指精液中呈直线前进运动精子所占的百分率，通常用十分制表示。由于只有具有前进运动的精子才可能具有正常的生存能力和授精能力，所以精子活力是评价种公鸡繁殖潜力的首要指标。精子活力对家禽生产、制种和育种等多个环节的效率产生重要的影响。尤其是随着种鸡笼养化程度的提高、精液稀释、储存技术的发展以及人工授精技术的普及，种公鸡配种能力提高，公母配比可以达到1:80。因此，种公鸡精子活力的高低对种蛋受精率的影响远远大于母鸡。调查研究显示，未经选育的地方品种鸡普遍存在精子活力偏低的情况，一定程度上影响了育种进展。因此，提高种公鸡的精子活力是种公鸡选育的重要育种目标之一。精子活力性状的常规表型选择方法有以下缺点：1.测定时间长。精子活力性状测定前需要对种公鸡进行1-2周的采精训练，一次测定结果不稳定，每只公鸡需要至少连续测定5次以上，每次测定间隔1天，甚至需要在不同的周龄多次进行测定。2.测定结果受到主观因素影响较大。精子活力通常需要工作人员通过专业的相差显微镜进行测定，个人的主观判断和对技术掌握的娴熟程度将会对测定结果产生一定的影响，降低准确性。3.计算机辅助精液质量分析系统(Computer-aidedsemenanalysis,CASA)可以用于比较客观测定精子活力性状，但是目前开发的分析软件主要针对人和牛等哺乳动物，家禽精子形态与哺乳动物差异较大，主流的分析软件不适用鸡，目前可用于鸡精子活力分析的CASA较少，且价格昂贵。以上缺点都会导致在公鸡繁殖力的选育上存在选种不准确、人力和物力耗费多的问题，增加选育成本，降低选育进展。miRNA是一类长度在21～25nt的内源性非编码单链RNA分子，具有调控基因转录的作用。研究表明，miRNA在睾丸内的各种生殖细胞中广泛表达，在精子发生和精子活力过程中作为调节因子可能发挥着至关重要的作用。miRNA和其调控的mRNA通常呈负相关关系，因此通过对特定时期和特定组织中miRNA和mRNA表达谱进行高通量测序和联合分析，结合miRNA靶基因预测结果，可以较为准确的锁定miRNA及其调控的功能基因。精子活力性状关键基因相关的miRNA作为分子标记，可以实现目标性状的早期和准确选择，加快精子活力性状的选育进展。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种与鸡精子活力和受精率性状相关的miRNA及其应用。本专利技术首先提供一种与鸡精子活力和受精率性状相关的miRNA，所述miRNA的靶标基因是AHI1。进一步地，所述miRNA为gga-miR-7480-5p，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术进一步提供了前述miRNA在调控鸡精子活力和受精率中的应用，所述miRNA通过调控AHI1基因的表达，调控鸡精子活力。本专利技术还提供了前述miRNA作为分子标记在标记辅助育种中用于提高鸡精子活力和受精率的应用。进一步地，所述应用具体为通过检测鸡睾丸组织中所述miRNA的表达水平，判断鸡精子活力的高低从而进行筛选。本专利技术还提供了检测前述miRNA表达水平的方法，所述方法包括如下步骤：(1)采集微量鸡睾丸组织，冻存于-80℃冰箱。(2)通过RNA提取试剂盒提取待测鸡睾丸组织中的总RNA；(3)使用Qiagen公司的miScriptIIRTkit进行miRNA反转录；；(4)采用miRNA特异上游引物5’-TTCTGAACGAGACTGAAGGAAGC-3’及使用于加尾法的荧光定量PCR试剂盒进行gga-miR-7480-5p的扩增；选择U6作为内参基因，扩增后利用2-ΔΔCt法进行定量结果的分析。本专利技术还提供了一种检测鸡睾丸组织中gga-miR-7480-5p表达量的荧光定量PCR试剂盒。所述试剂盒包括：反转录试剂、目的miRNA的特异性上游引物、内参上游引物和荧光定量PCR反应液。所述目的miRNA的特异性上游引物序列为5’-TTCTGAACGAGACTGAAGGAAGC-3’，内参上游引物为5’-GTGACCCACGATGTGTATTCGC-3’。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供的miRNA(gga-miR-7480-5p)与鸡精子活力和受精率相关，通过测序和荧光定量PCR研究，gga-miR-7480-5p在高低精子活力和受精率的样本间差异表达量达到3.2倍。本专利技术提供的miRNA可用于鸡精子活力和受精率性状的辅助选择育种。本专利技术提供的检测gga-miR-7480-5p表达水平的荧光定量PCR试剂盒包含了荧光定量试验所用的整套试剂，方便实用，提高结果一致性。附图说明图1为gga-miR-7480-5p在高、低精子活力组个体中相对表达量结果；图2为AHI1基因在高低精子活力组个体中相对表达量结果。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例1基于高通量测序技术的miRNA和mRNA联合分析获得鸡精子活力和受精率性状相关基因miRNA(gga-miR-7480-5p)及其靶基因AHI1。1.试验动物筛选和样本采集以饲养于中国农业科学院北京畜牧兽医研究所昌平试验基地的200只38周龄的北京油鸡公鸡作为试验动物。在38-40周龄，由饲养员每隔1天进行一次腹部按摩训练采精。40周龄起，每隔一天采集一次精液，通过相差显微镜进行精子活力测定，测定5次。根据精子活力检测结果，挑选出高精子活力和低精子活力各20只公鸡。选用同一世代的400只北京油鸡母鸡，与上一步筛选的40只公鸡按照1:10公母比进行人工授精。按照精子密度，对采集的精液按比例稀释，确保每只母鸡生殖道输入统一的精子数。每只公鸡收集100只以上种蛋入孵。在入孵后第10日照蛋，统计未受精蛋个数，计算每只公鸡对应种蛋的受精率(％)＝[(入孵数-未受精蛋数)/入孵数]×100％。采用SAS8.0软件的one-wayANOVA进行数据分析，结果以“平均数±标准差”表示。根据精子活力和种蛋受精率结果，筛选高精子活力、高受精率和低精子活力、低受精率组公鸡各3只作为测序样本。测序样本的精子活力和种蛋受精率如表1所示。表1测序样本的精子活力和种蛋受精率屠宰上述6只公鸡，采集睾丸组织样本迅速放入液氮，随后转入-80℃超低温冰箱保存。利用RNA提取试剂盒提取睾丸组织总RNA，构建用于miRNA和mRNA测序的文库，送具有测序资质的公司进行miRNA和mRNA的测序。2.基于高通量测序结果分析差异表达miRNA和mRNA使用Stringtie软件对mRNA进行表达定量。mRNA的表达量采用FPKM(FragmentsPerKilobaseofexonmodelperMillionmappedfragments)进行归一化处理，采用Ballgown软件包分析表达量，筛选出在高精子活力和低精子活力组显著差异表达的mRNA，筛选标准为P-value<0.05和|Foldchange|>1.5。miRNA的表达量采用TPM(Transcriptspermillionreads)方法进行归一化处理，采用edgeR软件分析表本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种与鸡精子活力性状和受精率性状相关的miRNA，其特征在于，所述miRNA的靶标基因是AHI1。

【技术特征摘要】
1.一种与鸡精子活力性状和受精率性状相关的miRNA，其特征在于，所述miRNA的靶标基因是AHI1。2.根据权利要求1所述的miRNA，其特征在于，所述miRNA为gga-miR-7480-5p，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。3.权利要求1或2所述的miRNA在调控鸡精子活力和受精率中的应用，其特征在于，所述miRNA通过调控AHI1基因的表达，调控鸡精子活力。4.权利要求1或2所述的miRNA作为分子标记在遗传标记辅助育种中提高鸡精子活力和受精率中的应用。5.根据有权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用具体为通过检测鸡睾丸组织中所述miRNA的表达水平，判断鸡精子活力的高低，从而进行筛选。6.检测权利要求1或2所述miRNA表达水平的方法，其特征在于，所述方法包...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙研研，刘一帆，倪爱心，李云雷，谢金防，陈继兰，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11