本发明专利技术公开了一种异源重组毕赤酵母工程菌GS115‑pPIC9K‑LacGWLF，所述异源重组毕赤酵母工程菌携带来源于短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)CotA漆酶优良突变体GWLF的目的基因；将优化的GWLF漆酶基因重组进毕赤酵母GS115基因组得到的所述工程菌。本发明专利技术重组毕赤酵母阳性菌株经过甲醇诱导培养、发酵条件优化和5L发酵罐高密度发酵，可用于制备重组GWLF漆酶。
A heterologous recombinant Pichia pastoris engineering strain GS115-pPIC9K-LacGWLF and its application
The present invention discloses a heterologous recombinant Pichia pastoris engineering strain GS115 pPIC9K LacGWLF, which carries the target gene from a cotA laccase mutant GWLF of Bacillus pumilus, and recombines the optimized GWLF laccase gene into the GS115 genome of Pichia pastoris. The recombinant Pichia pastoris positive strain of the invention can be used to prepare recombinant GWLF laccase by methanol induction culture, optimization of fermentation conditions and high-density fermentation in 5L fermentation tank.
【技术实现步骤摘要】
一种异源重组毕赤酵母工程菌GS115-pPIC9K-LacGWLF及其应用
本专利技术涉及一个来自短小芽孢杆菌的CotA漆酶突变体GWLF及其基因、工程菌和制备方法，具体设计基因工程技术和分子生物学手段获得表达该新型漆酶的重组表达菌株，以及该细菌漆酶蛋白在染料脱色工业上的应用，属于酶的基因工程领域。
技术介绍
漆酶(Laccase，E.C.1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，属于蓝色多铜氧化酶家族的一员,可分为四大类：植物漆酶、昆虫漆酶、真菌漆酶和细菌漆酶。它能够催化多种酚类和非酚类化合物氧化，使之生成相应的苯醌，同时伴随电子的转移，将分子氧还原成水，且反应过程中无其它副产物生成。漆酶的氧化底物极为广泛，包括酚类及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物等，因此漆酶应用潜力巨大。在木材加工领域，漆酶能代替化学胶合剂，不但能提高产品质量，而且能减轻对人体健康的伤害及对环境的污染；在造纸工业中，漆酶用于纸张生物漂白和制浆，可减少制浆造纸厂的污染，有助于造纸业最终实现清洁生产；在食品加工领域，漆酶可用于除去果汁中酚类化合物引起的混浊，从而提高果汁的质量。此外，漆酶还可氧化氯酚及其衍生物，降低其毒性，减少以氯酚类为工业原料生产染料、防腐剂、除草剂、杀虫剂等化工产品而造成的环境污染。对于许多应用，可以通过使用介体来提高漆酶的氧化能力。目前已知的介体包括：HBT(1-羟基苯并三唑)、ABTS(2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐、丁香酸甲酯、NHA(N-羟基乙酰苯胺)、NEIAA(N-乙酰基-N-苯基羟胺)、HBTO(3-羟基1,2,3-苯并三嗪-4(3H)酮)、VIO(紫尿酸)。在这些漆酶中，CotA漆酶最受研究者关注，其中枯草芽胞杆菌CotA漆酶的研究最多，最深入。由于真菌来源漆酶在工作环境pH偏碱性时活性非常低或几乎没有，热稳定性也较差，且丝状真菌生长周期长，培养基要求高，菌丝在发酵罐中易受到高剪切力的损伤，这大大限制了真菌漆酶在工业上的应用。研究揭示，细菌来源漆酶虽氧化活性普遍略低于真菌来源漆酶，然而它们往往具有一些自身独特的优点：如无需糖基化修饰、热稳定性好、酶活性的最适pH范围广等，这些性质正是目前漆酶工业应用所急需的。然而细菌漆酶本身的表达量较真菌漆酶要低，且在大肠杆菌中易形成包涵体，包涵体的复性比较困难，耗费物力财力。近些年，毕赤酵母异源表达被运用解决细菌漆酶胞外表达上，并取得良好效果，细菌漆酶成功的通过毕赤酵母实现外分泌表达，将有利于其在工业上的应用。毕赤酵母是一种单细胞低等真核生物，培养条件普通，生长繁殖速度迅速。毕赤酵母系统用于表达基因工程产品时，可以大规模生产，有效降低了生产成本。毕赤酵母表达系统在表达外源目的蛋白时具有很多优点，具有广阔的前景，适合工业化和规模化生产，该表达系统的优点主要表现在：1、表达量高：毕赤酵母表达系统的表达载体，是以醇氧化酶基因的启动子启动表达的，其外源目的蛋白的表达量很高，Pichiapastoris的表达量比一般表达系统的表达量(常用表达系统的表达量一般在毫克级)高10倍甚至100倍。2、稳定性高：毕赤酵母表达系统的表达载体通过整合在酵母的染色体上而存在，并且随染色体的复制而复制，不是以质粒自我复制的形式存在，因此重组菌株的稳定性很高。3、高分泌表达：毕赤酵母表达系统的表达载体中a因子前导序列是一个具有很好的分泌效果的分泌型号序列，能够通过一定的途径是表达产物分泌到细胞外，同时减轻了宿主细胞的代谢负荷，有利于细胞的持续生长。4、目的蛋白翻译后的加工和修饰：毕赤酵母具有真核生物完整的亚细胞结构，能够进行真核生物蛋白翻译后的加工修饰过程(如糖基化、脂肽化、磷酸化以及二硫键的形成等)，从而使分泌蛋白的结构更接近于天然蛋白，而且糖基化程度合适，适于临床使用。5、遗传背景研究较清楚，能够通过基因表达调控机制实现目的蛋白的高水平表达。6、易于进行工业化生产，毕赤酵母属于单细胞微生物，具有生产成本低，营养要求简单(酵母的碳源一般为甘油。葡萄糖以及甲醇等)，发酵工艺简单，可进行高密度发酵等优点，酵母具有大规模发酵生产外源蛋白的潜力，而且酵母表达系统自我分泌的杂蛋白很少，对于目的蛋白的纯化有利。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术申请人提供了一种异源重组毕赤酵母工程菌GS115-pPIC9K-LacGWLF及其应用。本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种表达来源于短小芽胞杆菌的CotA漆酶突变体GWLF毕赤酵母工程菌，重组毕赤酵母阳性菌株经过甲醇诱导培养、发酵条件优化和5L发酵罐高密度发酵，可用于制备重组GWLF漆酶。本专利技术的技术方案如下：一种异源重组毕赤酵母工程菌GS115-pPIC9K-LacGWLF，所述异源重组毕赤酵母工程菌携带来源于短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)CotA漆酶优良突变体GWLF的目的基因；将优化的GWLF漆酶基因重组进毕赤酵母GS115基因组得到的所述工程菌。按照毕赤酵母密码子偏好性对GWLF的基因进行优化，密码子优化的GWLF漆酶基因的核酸序列如SEQ.ID.No.1所示。所述优化的GWLF漆酶基因的氨基酸序列如SEQ.ID.No.2所示。一种含有所述目的基因的质粒或细胞。一种所述异源重组毕赤酵母工程菌的应用，将其用于制备GWLF漆酶。一种所述异源重组毕赤酵母工程菌制备GWLF漆酶的方法，包括如下步骤：(1)将优化的GWLF漆酶基因连入毕赤酵母表达载体pPIC9K，得到重组表达载体pPIC9K-LacGWLF；(2)将重组表达载体pPIC9K-LacGWLF经SacI单酶切线性化之并纯化后电转化至GS115菌株，得到异源重组酵母工程菌GS115-pPIC9K-LacGWLF，并在含100μg/Lzeocin的YPD平板进行阳性转化子筛选；以YPD平板上的转化子为模板，以5′AOX1和3′AOX1为引物进行PCR鉴定。PCR鉴定正确的转化子接种到含有0.3mMABTS和0.25mMCuSO4的BMMY平板上进行活性鉴定，菌落周围出现蓝绿色反应圈的转化子为重组毕赤酵母工程菌GS115-pPIC9K-LacGWLF；(3)挑取重组毕赤酵母工程菌接种到BMGY培养基，30℃，200rpm培养至OD600＝2-6，于8000×g，4℃离心5min收集细胞，然后收集的细胞重悬到BMMY培养基至起始OD600接近于1.0，于30℃，200rpm震荡培养，每天补加终浓度为0.5％的甲醇；发酵四天后在8000×g，4℃离心5min回收发酵液上清液；用亲和层析的方法对上清液进行纯化，SDS-PAGE分析可得明显特异条带；所述BMMY培养基中含有0.25mMCuSO4，收集重组GWLF。一种重组GWLF的应用，将其用于偶氮染料的脱色降毒。本专利技术有益的技术效果在于：本专利技术获得一株提供一种表达来源于短小芽胞杆菌的CotA漆酶突变体GWLF毕赤酵母工程菌，且上述CotA漆酶突变体和野生型CotA漆酶相比，其催化效率和表达效率分别提高了4.73和4.40倍。本专利技术优化毕赤酵母异源分泌表达重组GWLF的发酵条件，优化后的重组GWLF酶活提高了约4倍。克服了细菌漆酶产量低、酶活低、纯化困难等应用缺陷。本专利技术参考重组G本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种异源重组毕赤酵母工程菌GS115‑pPIC9K‑LacGWLF，其特征在于，所述异源重组毕赤酵母工程菌携带来源于短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)CotA漆酶优良突变体GWLF的目的基因；将优化的GWLF漆酶基因重组进毕赤酵母GS115基因组得到的所述工程菌。
【技术特征摘要】
1.一种异源重组毕赤酵母工程菌GS115-pPIC9K-LacGWLF，其特征在于，所述异源重组毕赤酵母工程菌携带来源于短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)CotA漆酶优良突变体GWLF的目的基因；将优化的GWLF漆酶基因重组进毕赤酵母GS115基因组得到的所述工程菌。2.根据权利要求1所述的异源重组毕赤酵母工程菌GS115-pPIC9K-LacGWLF，其特征在于，所述优化的GWLF漆酶基因的核酸序列如SEQ.ID.No.1所示。3.根据权利要求1所述的异源重组毕赤酵母工程菌GS115-pPIC9K-LacGWLF，其特征在于，所述优化的GWLF漆酶基因的氨基酸序列如SEQ.ID.No.2所示。4.一种含有权利要求1所述目的基因的质粒或细胞。5.一种权利要求1所述异源重组毕赤酵母工程菌的应用，其特征在于，将其用于制备GWLF漆酶。6.根据权利要求5的应用，其特征在于，所述制备GWLF漆酶的方法包括如下步骤：(1)将优化的GWLF漆酶基因连入毕赤酵母表达载体pPIC9K，得到重组表达载体pPIC9K-LacGWLF；(2)将重组表达载体pPIC9K-LacGWLF经...
【专利技术属性】
技术研发人员：管政兵，夏静，廖祥儒，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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