合成低聚异麦芽糖的解脂亚罗威酵母菌株及其合成方法技术

本发明专利技术公开了一株合成低聚异麦芽糖的解脂亚罗威酵母菌株及其合成方法；本发明专利技术利用食品安全微生物解脂亚罗威酵母Yarrowia lipolytica作为酶表达宿主，将食品级微生物的合成低聚异麦芽糖的不同基因进行优化改进，设计构成不同的基因表达盒，转化解脂亚罗威酵母Yarrowia lipolytica，获得能高效催化淀粉、糊精或者麦芽糖生产低聚异麦芽糖的工程菌株。培养该工程酵母菌株获得细胞，作为酶源，实现一步法由淀粉、糊精或者麦芽糖合成低聚异麦芽糖，最高转化率达到75％。本发明专利技术提供的食品级菌株及用其合成低聚异麦芽糖的方法简化了生产步骤、提高了生产效率，因而可以显著降低低聚异麦芽糖规模化生产的成本。

【技术实现步骤摘要】
合成低聚异麦芽糖的解脂亚罗威酵母菌株及其合成方法
本专利技术属于食品生物
，涉及一株合成低聚异麦芽糖的解脂亚罗威酵母菌株及其合成方法。
技术介绍
低聚异麦芽糖(Isomalto-oligosaccharide,简称IMO)是一种重要的功能性低聚糖，一般由2-10个葡萄糖以糖苷键进行连接，这些糖苷键中至少含有一个α-1,6糖苷键，也可能含有极少数的α-1,3糖苷键。低聚异麦芽糖常包含多种组分，如异麦芽糖(IG2)、异麦芽三糖(IG3)、潘糖(P)、异麦芽四糖(IG4)，结构式如图1，其中A、B、C分别代表异麦芽糖、潘糖和异麦芽三糖。目前国家标准根据产品的纯度将低聚异麦芽糖分成了IMO-50和IMO-90两种，IMO-50中IG2+P+IG3含量占35％以上，IMO-90中IG2+P+IG3含量达45％以上。目前已知低聚异麦芽糖极少以游离的状态存在于自然界，一般作为多糖或者分支链淀粉的组成部分，在清酒、蜂蜜、酱类及果葡糖浆中才有少量存在。低聚异麦芽糖具有优异的生理效应。它能促进消化道内多种有益细菌的生长繁殖，是一种优良的益生元(prebiotics)。其主要生理功效如下：(1)调节人体脂类物质代谢：低聚异麦芽糖基本不含单糖或含量极低，又很难被唾液酶、胃液及小肠中的酶消化利用，不增加血液中糖和胆固醇的含量，且属于非胰岛素依赖性，糖尿病患者可以放心食用；(2)合成机体必需维生素，并促进矿物质吸收：低聚异麦芽糖是肠道内双歧杆菌的增殖因子，可促进其增殖，增加机体合成B族维生素，促进钙、镁、铁等矿物质元素的吸收，提高机体免疫力；(3)预防龋齿，抑制牙垢：一般蛀牙主要是由链球菌造成，而低聚异麦芽糖很难被其分解，从而达到预防龋齿的作用，同时在与蔗糖结合时可抑制不溶性葡聚糖合成的产生，可以很好的抑制牙垢的形成；(4)调节肠道菌群：低聚异麦芽糖促进双歧杆菌和乳酸菌增殖促进食物消化吸收，降低肠道PH，促进肠道蠕动，改善肠道功能；(5)保护肝功能：如果肝功能发生异常，势必会影响肠道菌群，同样的将肠道菌群向良性调节必有利于肝功能的正常发挥。口服高浓度的低聚异麦芽糖产品可以调节肠道菌群，降低有毒物质含量，大大增加蛋白质耐受性，增加体重。由于低聚异麦芽糖具有上述优异的生理功能，使得其在食品及医疗保健品中得到非常广泛的应用，市场销量巨大，国内外对生产低聚异麦芽糖的方法进行了大量的研究。目前在工业上经典的生产低聚异麦芽糖的主要采用的是多酶协同转化法。一般需要利用α-淀粉酶、β-淀粉酶、普鲁兰酶、转苷酶。从淀粉出发经液化(耐高温α-淀粉酶)、糖化(β-淀粉酶、普鲁兰酶)、转苷作用(α-葡萄糖转苷酶)这一多酶协同步骤生产得到低聚异麦芽糖。产物中除了含有低聚异麦芽糖外，还含有40％～50％的葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖以及低聚麦芽糖等以α-1,4糖苷键连接的寡糖。再经过过滤、脱盐、脱色、分离、浓缩、干燥得到低聚异麦芽糖IMO-50或高纯度的IMO-90，其工艺流程如下图2。该方法存在很多问题，如工序过多、工艺参数难控制、时间过长、难以实现连续化生产等诸多缺点，尤其需要单独制备或者购买比较昂贵的酶制剂，如β-淀粉酶、普鲁兰酶、α-葡萄糖转苷酶。这些都使得规模化生产IMO的成本较高。早在1993年就有报道(Kuriki等，Anewwayofproducingisomalto-oligosaccharidesyrupbyusingthetransglycosylationreactionofneopullulanase.ApplEnvironMicrobiol,1993,59:953-959)，根据新普鲁兰酶(neopullulanase)既有水解酶又有转苷酶的特性，从枯草芽孢杆菌中分离纯化新普鲁兰酶，利用α-淀粉酶先液化淀粉，然后将液化的淀粉加入纯化的新普鲁兰酶，可以得到低聚异麦芽糖的转化液，由淀粉合成低聚异麦芽糖的得率达到45-60％。这种方法虽然不需要经典的多酶协同转化，但是该方法需要制备纯酶新普鲁兰酶，而制备纯酶的过程比较繁多，成本较大，不利于降低规模化生产低聚异麦芽糖的成本。若不制备纯酶，其它来源芽孢杆菌的杂酶会污染产品。2002年韩国学者Lee等报道了利用α-葡糖转移酶与产麦芽糖淀粉酶双酶协同以淀粉合成低聚异麦芽糖的方法(Lee等，Cooperativeactionofα-glucanotransferaseandmaltogenicamylaseforanimprovedprocessofisomaltooligosaccharideproduction,JAgriFoodChem,2002,50:2812-2817)。采用该双酶协同的方法，由淀粉合成IMO的得率提高到68％，而且含有相对较长链的IMO。该方法需要先制备这两种纯酶，也存在酶制备成本大的缺点，难以实现规模化生产。最近，丹麦学者Sorndech等人报道了一种双酶协同由淀粉合成低聚异麦芽糖的方法(Sorndech等，CombinationofamylaseandtransferasecatalysistoimproveIMOcompositionsandproductivity.LWT-FoodSciTechnol,2017,79:479-486)。同时将特殊的淀粉酶与分支酶加入到淀粉乳化液中，液化淀粉后再加入转苷酶反应得到低聚异麦芽糖。这种方法不用像经典的方法那样逐个加入α-淀粉酶、β-淀粉酶、普鲁兰酶以及转苷酶，而是同时加入特殊的淀粉酶与分支酶，然后再加入转苷酶，具有一定的简便性，但是缺点是同样需要制备多种纯化酶，成本很高。因此，研究开发一种较多酶协同合成低聚异麦芽糖更简便的方法，对于提高合成效率降低成本具有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有的酶合成低聚异麦芽糖的不足之处，提供了一株直接由淀粉、糊精或者麦芽糖或者其组合物合成低聚异麦芽糖的菌株，及用其合成低聚异麦芽糖的方法。本专利技术提供的能合成低聚异麦芽糖的解脂亚罗威酵母菌株，该菌株经过培养，即含有能催化淀粉合成低聚异麦芽糖的酶类，而且这些酶类可以分泌到胞外培养基，也可以展示固定在细胞表面，用此酵母细胞或者胞外的酶类作为催化剂，能催化底物(淀粉、糊精、麦芽糖或者其组合物)合成低聚异麦芽糖。解脂亚罗威酵母属于公认安全的酵母菌株，在食品发酵领域具有重要的应用。有的能高效合成柠檬酸，有的能高效合成赤藓糖醇。同时，该酵母也是常用的异源蛋白表达宿主，用于高效表达具有功能的酶(Nicaudetal,ProteinexpressionandsecretionintheyeastYarrowialipolytica.FEMSYeastResearch,2002,2:371-379)。在本专利技术中，我们以解脂亚罗威酵母为出发菌株(Yarrowialipolytica)构建了能够合成低聚异麦芽糖的新菌株解脂亚罗威酵母。本专利技术中使用的合成低聚异麦芽糖的酵母菌株是解脂亚罗威酵母(Yarrowialipolytica)，已经于2018年5月11日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCCNO.14785。本专利技术中使用的解脂亚罗酵母Yarrow本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种代谢工程改良的解脂亚罗威酵母菌株，其特征在于，该菌株含有如下异源基因表达盒中的至少一种：(1)α‑淀粉酶基因表达盒；(2)β‑淀粉酶基因表达盒；(3)新普鲁兰酶基因表达盒；(4)产麦芽糖淀粉酶基因表达盒；(5)葡萄糖转苷酶基因表达盒；(6)α‑葡萄糖苷酶基因表达盒。

【技术特征摘要】
2018.05.14 CN 20181045543491.一种代谢工程改良的解脂亚罗威酵母菌株，其特征在于，该菌株含有如下异源基因表达盒中的至少一种：(1)α-淀粉酶基因表达盒；(2)β-淀粉酶基因表达盒；(3)新普鲁兰酶基因表达盒；(4)产麦芽糖淀粉酶基因表达盒；(5)葡萄糖转苷酶基因表达盒；(6)α-葡萄糖苷酶基因表达盒。2.如权利要求1所述的解脂亚罗威酵母菌株，其特征在于，所述菌株含有α-淀粉酶基因表达盒、产麦芽糖淀粉酶基因表达盒和α-葡萄糖苷酶基因表达盒。3.如权利要求1所述的解脂亚罗威酵母菌株，其特征在于，所述菌株以解脂亚罗威酵母(YarrowialipolyticaBLC13)CGMCCNO.7326或用于蛋白表达宿主的解脂亚罗威酵母Yarrowialipolytica菌株为出发菌株。4.如权利要求1、2或3所述的解脂亚罗威酵母菌株，其特征在于，所述菌株能合成低聚异麦芽糖。5.如权利要求4所述的解脂亚罗威酵母菌株，其特征在于，所述菌株为解脂亚罗威酵母YarrowialipolyticaCGMCCNO.14785。6.一种如权利要求1～5中任一项所述的解脂亚罗威酵母菌株在合成低聚异麦芽糖中的用途。7.一种用如权利要求1～5中任一项所述的解脂亚罗威酵母菌株合成低聚异麦芽糖的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1、将所述解脂亚罗威酵母菌株在含碳源、氮源...

【专利技术属性】
技术研发人员：程海荣，刘大文，王思绮，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海,31