猪口蹄疫O型基因工程复合表位蛋白疫苗的生产方法技术

本发明专利技术涉及一种猪口蹄疫O型基因工程复合表位蛋白疫苗的工业化生产方法，按照先后顺序包括以下步骤：(1)工程菌发酵与诱导表达；(2)菌体收集与破碎；(3)包涵体洗涤与变性溶解；(4)蛋白纯化；(5)纯化蛋白复性；(6)疫苗乳化。本发明专利技术的有益效果为：产品质量方面：疫苗无菌，目的蛋白纯度达95％以上，有效抗原含量在1.0mg/mL以上，间接血凝抑制效价在1：2

【技术实现步骤摘要】
猪口蹄疫O型基因工程复合表位蛋白疫苗的生产方法
本专利技术属于免疫
，具体涉及一种猪口蹄疫O型基因工程复合表位蛋白的生产方法。
技术介绍
口蹄疫(Foot-and-MouthDisease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-MouthDiseaseVirus,FMDV)引起的偶蹄动物烈性传染病，是世界动物卫生组织(OIE)规定必报的烈性传染病，我国将其排列在一类传染病之首。口蹄疫病毒共有七个血清型，分别为O、A、C、AsiaⅠ、SAT1、SAT2、SAT3型，已发现在我国流行的有O、A和AsiaⅠ型，而O型口蹄疫是目前危害最为严重的血清型，疫情连年不断，造成了严重的经济损失。目前，在我国存在的O型口蹄疫流行毒有缅甸98(Mya98)、泛亚(PanAsia)和中国型(Cathay)三个谱系，其中缅甸98系流行最为广泛。该病的发生与流行严重阻碍了社会经济的发展，制约健康养殖，是我国急需解决的重要问题之一。我国采取疫苗免疫与扑杀相结合的综合措施防控口蹄疫，国家免费对所有家畜进行强制免疫。目前使用的主要为灭活疫苗。但因口蹄疫病毒本身免疫原性弱，疫苗的免疫持续期较短，需要多次免疫，免疫动物会产生3ABC抗体，不利于感染与免疫的鉴别。另外，灭活疫苗的产生需要高级别的防护措施以消除病毒逃逸等安全隐患。由于这些因素，促使人们研制高效安全的新型口蹄疫疫苗。口蹄疫病毒结构蛋白VP1G-H环与其C-端序列是最主要的线性中和表位，通过表达或者用合成此肽段免疫牛不能获得完全的免疫保护(Tabogaetal.,1997；Wangetal.,2002；Rodriguezetal.,2003；Zhangetal.,2015)。但是，用类似的合成肽疫苗免疫猪体能够提供对同源病毒的较好免疫保护力(Tabogaetal.,Wangetal.,2002；Shaoetal.,2011；Zhangetal.,2015)。本研究设计了多个表位串联的免疫原基因，涵盖了我国历史和当前发生的中国型(2个亚系)、泛亚系和缅甸98三个谱系O型口蹄病毒主要中和性抗原表位区，加上通用T细胞表位，在原核细胞中表达、纯化复性后免疫小鼠，挑选出免疫原性与交叉反应性最好的蛋白作为制苗抗原，以诱导树突状细胞(DC)成熟分化的CpG作为免疫增强剂，两者配伍并经ISA201VG油佐剂乳化制成疫苗，研制了猪口蹄疫O型复合表位蛋白疫苗。与现有口蹄疫灭活疫苗相比，猪口蹄疫O型复合表位蛋白疫苗的生产不动用活毒，即不需要灭活工艺、不含口蹄疫全病毒核酸，非常安全；本疫苗也不含有任何口蹄疫病毒非结构蛋白成分，即多次免疫都不会产生非结构蛋白抗体，避免了对口蹄疫自然感染和疫苗免疫鉴别诊断的干扰，且生产成本相对低廉。本疫苗中加入CpG免疫增强剂，与poly(I:C)配伍的疫苗相比(Caoetal.,2013,2014)，在抗原递呈时，CpG的作用效果更好；本疫苗使用ISA201VG作为油佐剂，与ISA206乳化的疫苗相比(Renetal.,2011)，除了刺激体液免疫外，还能刺激细胞免疫应答，延长了蛋白免疫的免疫持续期，具有可用性。猪口蹄疫是由猪口蹄疫病毒引起的一种烈性传染病，传染性强，发病率高，给养猪业带来巨大的危害。目前我国猪O型口蹄疫预防用疫苗主要为传统的灭活疫苗和新型的合成肽疫苗。在口蹄疫防治方面，病毒灭活不完全或疫苗生产实验室里活的病毒泄漏极易造成FMD的爆发，而基因工程复合表位蛋白疫苗生产过程不涉及感染性的FMDV，不存在散毒的危险，能够作为一种新型疫苗使用。现有关于1.重组E.coli高密度发酵已经成功应用于生物制药领域，该技术具有周期短、培养成本低廉、代谢调控较为成熟等优点，极适合于企业大规模生产。现有公开号为CN103007273A的中国专利公开了一种一种口蹄疫基因工程混合表位疫苗及其制备方法，通过中国农科院兰州兽医研究所构建的BL21-FMDV-B4菌株，在同一种表位蛋白中引入多个谱系的保护性抗原表位，拓展表位蛋白的抗原谱，从而使表位蛋白疫苗所诱导产生的免疫应答更具有广谱性；通过与通用的T细胞表位融合设计，形成复合表位蛋白，刺激产生更全面的体液免疫与细胞免疫应答，并且可以通过重组E.coli高密度发酵已经成功应用于生物制药领域，该技术具有周期短、培养成本低廉、代谢调控较为成熟等优点，极适合于企业大规模生产。该技术为实验室制备的方法，生产成本高、单位产量小、不适合工业化生产。咱们的专利为规模化生产的方法，将传统的离心法改为超滤法、将传统的透析复性法改为稀释复性法，克服了大型仪器、设备的载量限制问题，在大幅节省生产成本、人力耗费、生产周期的前提下生产出与实验室品质相同的猪口蹄疫O型复合表位蛋白疫苗，为实现国家中长期口蹄疫防控战略目标提供有力保障。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种猪口蹄疫O型基因工程复合表位蛋白的生产方法，按照先后顺序包括以下步骤：步骤(1)：工程菌培养与诱导表达：取工程菌种子液接种LB培养液中进行发酵，发酵完后加入IPTG进行诱导表达，得诱导表达后的第一重组蛋白发酵液；步骤(2)：菌体收集与破碎：使用中空纤维柱对收集到的上述的第一重组蛋白发酵液进行浓缩处理，然后再进行破碎处理得到第二重组蛋白发酵液；步骤(3)：包涵体洗涤与变性溶解：使用缓冲液对中空纤维柱内的第二重组蛋白发酵液进行洗涤，再经浓缩和离心处理，弃上清，沉淀物沥干水分后加入IBSolubilizationBuffer，混匀，室温孵育，至蛋白完全溶解，再次离心，上清液即为粗提的包涵体；步骤(4)：蛋白纯化：使用蛋白纯化系统使上述包涵体内的目的蛋白与填料发生完全的特异性结合，用WashingBuffer洗净未结合杂蛋白，再用两种不同洗脱缓冲液收集洗脱液，即为目的蛋白，再将收集的洗脱液通过离心弃去不可溶物质，上清液即为纯化蛋白液。步骤(5)：纯化蛋白复性：使用稀释复性法，将上述纯化蛋白液加入到复性液中，静置过夜，再通过离心弃去不可溶物质，使用超滤膜包将其浓缩，即为抗原，除菌后分装备用。优选的是，步骤(1)中，发酵条件为：37℃、PH7.2、溶氧40％、增菌5小时，诱导表达5小时。在上述任一方案中优选的是，步骤(2)中，所述中空纤维柱的规格为750KD。在上述任一方案中优选的是，步骤(3)中，所述缓冲液为冰浴的1×IBWashBuffer，所述IBSolubilizationBuffer为含有0.3％的N-十二烷基肌氨酸钠的1×IBSolubilizationBuffer。在上述任一方案中优选的是，步骤(3)中，首次离心的条件为4℃、10000r/min离心10min，第二次离心的条件为12000r/min离心10min。在上述任一方案中优选的是，步骤(4)中，所述填料为50％的Ni-NTAHis·BindResin。在上述任一方案中优选的是，步骤(4)中，所述WashingBuffer中NaH2PO4浓度为100mmol/L，Tris-HCl的浓度为10mmol/L，urea的浓度为8mol/L，所述WashingBuffer的pH为6.3。在上述任一方案中优选的是，步骤(4)中，所述两种不同的洗脱缓冲液中NaH2PO4浓度为100mmol/L，Tris-HCl的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪口蹄疫O型基因工程复合表位蛋白的生产方法，按照先后顺序包括以下步骤：步骤(1)：工程菌培养与诱导表达：取工程菌种子液接种LB培养液中进行发酵，发酵完后加入IPTG进行诱导表达，得诱导表达后的第一重组蛋白发酵液；步骤(2)：菌体收集与破碎：使用中空纤维柱对收集到的上述的第一重组蛋白发酵液进行浓缩处理，然后再进行破碎处理得到第二重组蛋白发酵液；步骤(3)：包涵体洗涤与变性溶解：使用缓冲液对中空纤维柱内的第二重组蛋白发酵液进行洗涤，再经浓缩和离心处理，弃上清，沉淀物沥干水分后加入IB Solubilization Buffer，混匀，室温孵育，至蛋白完全溶解，再次离心，上清液即为粗提的包涵体；步骤(4)：蛋白纯化：使用蛋白纯化系统使上述包涵体内的目的蛋白与填料发生完全的特异性结合，用Washing Buffer洗净未结合杂蛋白，再用两种不同洗脱缓冲液收集洗脱液，即为目的蛋白，再将收集的洗脱液通过离心弃去不可溶物质，上清液即为纯化蛋白液。步骤(5)：纯化蛋白复性：使用稀释复性法，将上述纯化蛋白液加入到复性液中，静置过夜，再通过离心弃去不可溶物质，使用超滤膜包将其浓缩，即为抗原，除菌后分装备用。...

【技术特征摘要】
1.一种猪口蹄疫O型基因工程复合表位蛋白的生产方法，按照先后顺序包括以下步骤：步骤(1)：工程菌培养与诱导表达：取工程菌种子液接种LB培养液中进行发酵，发酵完后加入IPTG进行诱导表达，得诱导表达后的第一重组蛋白发酵液；步骤(2)：菌体收集与破碎：使用中空纤维柱对收集到的上述的第一重组蛋白发酵液进行浓缩处理，然后再进行破碎处理得到第二重组蛋白发酵液；步骤(3)：包涵体洗涤与变性溶解：使用缓冲液对中空纤维柱内的第二重组蛋白发酵液进行洗涤，再经浓缩和离心处理，弃上清，沉淀物沥干水分后加入IBSolubilizationBuffer，混匀，室温孵育，至蛋白完全溶解，再次离心，上清液即为粗提的包涵体；步骤(4)：蛋白纯化：使用蛋白纯化系统使上述包涵体内的目的蛋白与填料发生完全的特异性结合，用WashingBuffer洗净未结合杂蛋白，再用两种不同洗脱缓冲液收集洗脱液，即为目的蛋白，再将收集的洗脱液通过离心弃去不可溶物质，上清液即为纯化蛋白液。步骤(5)：纯化蛋白复性：使用稀释复性法，将上述纯化蛋白液加入到复性液中，静置过夜，再通过离心弃去不可溶物质，使用超滤膜包将其浓缩，即为抗原，除菌后分装备用。2.根据权利要求1所述的猪口蹄疫O型基因工程复合表位蛋白的生产方法，其特征在于，步骤(1)中，发酵条件为：37℃、PH7.2、溶氧40％、增菌5小时，诱导表达5小时。3.根据权利要求1所述的猪口蹄疫O型基因工程复合表位蛋白的生产方法，其特征在于，步骤(2)中，所述中空纤维柱的规格为750KD。4.根据权利要求1所述的猪口蹄疫O型基因工程复合表位蛋白的生产方法，其特征在于，步骤(3)中，所述缓冲液为冰浴的...

【专利技术属性】
技术研发人员：宗惠，刘斌，刘杰，康文娟，邹慧芳，岳晓蓉，秦天达，陈晓宇，李金杰，牟克斌，黄银君，温建波，魏徵，邢向茹，
申请(专利权)人：天津威特生物医药有限责任公司，
类型：发明
国别省市：天津,12