肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型及其构建方法和构建系统技术方案

一种肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型及其构建方法和构建系统，其中，构建方法包括如下步骤：选取若干份相异人体的已经离体的肾移植术后急性排斥反应受者的外周血标本；分离T淋巴细胞；提取T淋巴细胞中的DNA；以DNA为模版，扩增出TCR的CDR3区，得到CDR3基因文库；采用高通量测序技术，对所述CDR3基因文库进行测序；对测序结果进行分析，构建肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型。通过对外周血中T细胞CDR3进行测序和分析，能够揭示急性排斥受者TCR CDR3的多样性，分析T淋巴细胞亚群中特异CDR3序列及TCR特征谱，评估急性排斥受者的免疫状态；发掘急性排斥发病过程的免疫组库改变，进一步研究肾移植术后急性排斥反应发病机制。

T-cell antigen receptor profile model and its construction method and system for acute rejection recipients after kidney transplantation

A model of T cell antigen receptor profile of recipients with acute rejection after kidney transplantation and its construction method and construction system are described. The construction method includes the following steps: selecting several peripheral blood samples of recipients with acute rejection after kidney transplantation, separating T lymphocyte, extracting DNA from T lymphocyte, and amplifying CDR3 of TCR using DNA as template. The CDR3 gene library was obtained, and the CDR3 gene library was sequenced by high throughput sequencing technology. The results of sequencing were analyzed and the T cell antigen receptor map model of recipients with acute rejection after renal transplantation was constructed. By sequencing and analyzing T cell CDR3 in peripheral blood, we can reveal the diversity of TCR CDR3 in recipients with acute rejection, analyze the specific CDR3 sequence and TCR characteristic spectrum in T lymphocyte subsets, evaluate the immune status of recipients with acute rejection, explore the changes of immunohistology bank in the course of acute rejection, and further study the pathogenesis of acute rejection after renal transplantation.

【技术实现步骤摘要】
肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型及其构建方法和构建系统
本专利技术涉及生物医学
，特别是涉及一种肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型及其构建方法和构建系统。
技术介绍
肾小球滤过率(glomerμLarfiltrationrate，GFR)是反映肾功能的良好指标，它是指单位时间内两肾生成原尿的量，临床上通常将肾脏损伤或肾小球滤过率低于60ml/(min·1.73m2)即为诊断为慢性肾脏病(chronickidneydisease，CKD)。各种CKD持续进展会导致慢性肾衰竭(chronicrenalfailure，CRF)，目前我国CRF发病率大概为每一百万人口中有100人。当各种慢性肾脏疾病发展到终末阶段，患者肾小球滤过率低于15ml/(min·1.73m2)或者需要透析治疗时即为终末期肾病(Endstagerenaldisease，ESRD)。根据流行病学资料显示，美国成年人2011年CKD发病率已经达到15.1％，中国目前的慢性肾脏病发病率为10.8％，随着病情的进展，肾功能逐渐衰竭，CKD患者最终将不可避免的发展成为终末期肾病(Endstagerenaldisease，ESRD)。ESRD导致人类直接或间接死亡的数量相应的迅速增长，其防治已成为一个全球面临的严峻公共卫生难题。治疗ESRD，延缓甚至防止相关并发症的发生，如何提高该庞大群体的生活质量，已成为全世界共同关注的难题。肾脏移植是一种肾脏替代治疗的手段，肾移植可以明显提ESRD患者的生活水平。目前肾移植术后患者面临的主要问题有两个：排斥反应和感染。据统计，目前每年大概约5％的移植肾丢失(Cecka,J.,CLINICALOUTCOMEOFRENALTRANSPLANTATIONFactorsInfluencingPatientandGraftSurvival.RENALTRANSPLANTATION:p.78:133)。排斥反应的发生是目前移植肾丢失的重要原因，其中急性排斥反应(acuterejection,AR)是各种排斥反应中最常见的。器官移植排斥反应实质上是人体对异体器官的免疫反应，T细胞(Tlymphocyte)在同种免疫反应中扮演者关键的起始者、介导者和效应者的“角色”，所以T细胞在同种异体移植物排斥反应中起至关重要的作用。急性排斥反应主要由细胞免疫反应造成，而晚期的急性排斥反应中有体液免疫的伴随。急性排斥反应发生时，受者体内会形成大量的细胞毒性T细胞直接对靶细胞造成杀伤，与此同时，T细胞辅助细胞活化产生各种细胞因子，帮助B细胞分化进而形成抗移植物抗体共同损伤移植物。因此，需要更深层次的了解与肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体的基因序列信息和多样性变化，因为这能更深层次的揭开T淋巴细胞参与肾移植术后急性排斥反应的机理，客观准确地评估肾移植术后急性排斥反应时免疫状态，进一步阐明膀胱癌的病因学及发病机制，进而为疾病预防、诊断、治疗和预后监测提供新的理论依据。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型的构建方法、构建系统及由构建方法制备得到的肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型。一种肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型的构建方法，包括步骤：选取若干份相异人体的已经离体的肾移植术后急性排斥反应受者的外周血标本；从外周血标本中分离T淋巴细胞；提取T淋巴细胞中的DNA，得到DNA提取液；以DNA提取液中的DNA为模版，扩增出TCR的CDR3区，得到CDR3基因文库；采用高通量测序技术对CDR3基因文库进行测序；对测序结果进行分析，构建肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型。一种肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型，由如上任一实施例中所述的构建方法制备得到。一种肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型的构建系统，采用如上任一实施例中所述的构建方法实现。上述肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型的构建方法，通过对外周血中T细胞CDR3进行测序和分析，能够揭示急性排斥受者TCRCDR3的多样性，分析T淋巴细胞亚群中特异CDR3序列及TCR特征谱，评估急性排斥受者的免疫状态；发掘急性排斥发病过程的免疫组库改变，进一步研究肾移植术后急性排斥反应发病机制。附图说明图1为本专利技术一实施方式的肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型的构建方法的步骤流程图；图2为本专利技术另一实施方式的肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型的构建方法的步骤流程图。具体实施方式为了便于理解本专利技术，下面将参照相关附图对本专利技术进行更全面的描述。附图中给出了本专利技术的较佳实施方式。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本专利技术的公开内容理解的更加透彻全面。当然，它们仅仅为示例，并且目的不在于限制本专利技术。此外，本专利技术可以在不同例子中重复参考数字和/或字母。这种重复是为了简化和清楚的目的，其本身不指示所讨论各种实施例和/或设置之间的关系。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本专利技术。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。例如，一种肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型的构建方法，请参阅图1，所述构建方法包括如下步骤：选取若干份相异人体的已经离体的肾移植术后急性排斥反应受者的外周血标本；从外周血标本中分离T淋巴细胞；提取T淋巴细胞中的DNA，得到DNA提取液；以DNA提取液中的DNA为模版，扩增出TCR的CDR3区，得到CDR3基因文库；采用高通量测序技术，对所述CDR3基因文库进行测序；对测序结果进行分析，构建肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型。为了进一步说明上述构建方法，又一个例子提供一种肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型的构建方法，请参阅图2，所述构建方法包括如下步骤。S110：选取若干份相异人体的已经离体的肾移植术后急性排斥反应受者的外周血标本。例如，本专利技术各实施例采用的离体的外周血标本，来自于2014年10月至2016年6月于中国人民解放军第一八一中心医院全军器官移植和透析中心住院接受同种异体肾移植术的终末期肾病(均符合2009年美国KDIGO制定的ESRD诊断标准)且术后1个月内发生急性排斥反应的患者，在19例急性排斥反应患者中选取其中3例较为典型的患者进行回顾性研究，其中男性患者1例61岁，女性患者2例，分别51岁和55岁，3例患者原发病均为慢性肾小球肾炎的终末期肾病(ESRD)，接受血液透析时间均在2年以上，无肝炎、结核等传染性疾病及自身免疫性疾病病史。上述患者在住院期间接受同种异体心死亡供体(donationaftercardiacdeath，DCD)供肾移植，其本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：选取若干份相异人体的已经离体的肾移植术后急性排斥反应受者的外周血标本；从外周血标本中分离T淋巴细胞；提取T淋巴细胞中的DNA，得到DNA提取液；以DNA提取液中的DNA为模版，扩增出TCR的CDR3区，得到CDR3基因文库；采用高通量测序技术，对所述CDR3基因文库进行测序；对测序结果进行分析，构建肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型。

【技术特征摘要】
1.一种肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：选取若干份相异人体的已经离体的肾移植术后急性排斥反应受者的外周血标本；从外周血标本中分离T淋巴细胞；提取T淋巴细胞中的DNA，得到DNA提取液；以DNA提取液中的DNA为模版，扩增出TCR的CDR3区，得到CDR3基因文库；采用高通量测序技术，对所述CDR3基因文库进行测序；对测序结果进行分析，构建肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在提取T淋巴细胞中的DNA，得到DNA提取液之后，以及在以DNA提取液中的DNA为模版，扩增出TCR的CDR3区，得到CDR3基因文库之前，所述构建方法还包括：测定DNA提取液中DNA含量及完整性，检测是否合格，是则执行下一步骤。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，采用琼脂糖凝胶电泳法测定DNA提取液的完整性。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，测定所述DNA待测液的完整性包括如下步骤：将DNA提取液与加样缓冲液混合后加入孔板通电进行电泳，在电压为150V的条件下电泳40分钟；取出凝胶，并在紫外灯下检查。5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，从外周血标本中分离T淋巴细胞，具体为：选用淋巴分离液分离外周血标本中的淋巴细胞，得到单个核细胞；选用免疫磁珠间接法从单个核细胞悬浮液中分离T淋巴细胞。6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，提取T淋巴细胞中的DNA，得到DNA提取液，具体为：取5000μL单个核细胞悬浮液放入10ml离心管中；加入20mg/ml蛋白酶K25微升，22℃～26℃条件下保存20分钟，中间颠倒离心管数次使其混合均匀，用200μL结合液CB加入到离心管中，马上颠倒数次使其充分混匀，于70℃～75℃水浴放置15分钟；加入100μL异丙醇，充分混匀，得到混合液；把混合液置于吸附柱当中，再使吸附柱置入收集管中，10000rpm离心0.5分钟，去除废液；加入45...

【专利技术属性】
技术研发人员：眭维国，戴勇，薛雯，欧明林，
申请(专利权)人：中国人民解放军第一八一医院，
类型：发明
国别省市：广西,45