测定孕酮的方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种测定孕酮的方法，包括：1)将样本与水溶性生物素修饰的孕酮或其衍生物以及抗孕酮抗体混合孵育，其中，所述抗孕酮抗体经吖啶类化学发光物质标记；2)加入链霉亲和素微粒；以及3)获得样本中孕酮的浓度。该方法能够改善孕酮的测定效果。本发明专利技术还涉及测定孕酮的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
测定孕酮的方法及试剂盒
本专利技术属于免疫检测领域，具体涉及一种用于测定孕酮的化学发光免疫测定方法。
技术介绍
孕酮(Progesterone)是人体中一种重要的21碳类固醇激素，分子量314.5道尔顿，为胆固醇代谢过程中的中间产物，由胆固醇经孕烯醇酮通过异构酶转化而成。其功能主要是维持黄体的生长和功能，预备受精卵着床，抑制子宫肌收缩等。血液中的孕酮主要与白蛋白、性激素结合球蛋白、皮质醇结合球蛋白等载体结合在体内进行循环。正常男性和女性产生的孕酮水平都很低。血液中的孕酮含量在女性月经周期的排卵前一天迅速升高。在受孕后，黄体继续分泌孕酮，并一直持续到妊娠的第十二周；此后，胎盘逐渐成为孕酮的主要来源。若未受孕，黄体萎缩，血液中的孕酮迅速降低至卵泡期水平。近年来，孕酮的测定方法主要有化学发光免疫分析法、酶免疫分析法和放射免疫分析法等，其中，吖啶类化学发光免疫分析法是孕酮的测定中的常用方法。在目前已建立的吖啶类化学发光检测体系中，如Abbott(雅培)公司的ARCHITECTProgesterone商品化孕酮检测试剂及SIEMENS公司的ADVIACP商品化孕酮检测试剂，均采用孕酮衍生物包被微粒来与样本中的孕酮竞争结合吖啶标记的抗体的方式来定量测定孕酮。虽然上述检测体系已经广泛应用于临床孕酮样本的测定，然而仍存在一定的缺陷。一方面，在上述试剂中孕酮衍生物与微粒相连，由于微粒体积、质量远大于孕酮抗原，所以在抗原与抗体结合时易产生空间位阻效应；另一方面，包被于微粒表面的孕酮衍生物一般为疏水结构，易因疏水作用聚集使得抗体不能有效识别其表位，由此导致孕酮衍生物不稳定的问题。据此，在采用吖啶化学发光分析来测定孕酮时，存在着改善反应过程中微粒带来的空间位阻效应及孕酮或其衍生物稳定性的需求；同时还存在进一步改善孕酮测定效果的需求。
技术实现思路
为达到上述目的，本专利技术人尝试多种方式对已有的测定方法进行调整，例如直接采用小分子吖啶化合物标记孕酮衍生物，或是采用BSA桥接吖啶与孕酮或其衍生物以解决上述空间位阻和/或稳定性问题。然而，不幸的是，这些方法均未能达到预期的效果。经过大量研究后，本专利技术人意外的发现采用如下方法能够有效地改善空间位阻效应及孕酮衍生物稳定性：先将水溶性生物素修饰的孕酮或其衍生物与样本中的孕酮竞争结合吖啶标记抗体；再加入链酶亲和素微粒与生物素修饰的孕酮衍生物结合(图1示出了本专利技术方法的实验原理)，继而实现了本专利技术。据此，在第一方面，本专利技术提供了一种基于直接化学发光法的孕酮测定方法，包括：1)将样本与水溶性生物素修饰的孕酮或其衍生物以及抗孕酮抗体混合孵育，其中，所述抗孕酮抗体经吖啶类化学发光物质标记；2)加入链霉亲和素微粒；3)分离链霉亲和素微粒；以及4)获得样本中孕酮的浓度。在优选的实施方式中，所述链霉亲和素微粒为链酶亲和素蛋白包被的磁微粒。在优选的实施方式中，所述链酶亲和素微粒的粒径为1～3μm，更优选为1μm。在优选的实施方式中，所述生物素为带有水溶性Linker的生物素，其水溶性Linker可以是-PEGn-(n＝1～10)、-SO3-和/或甜菜碱。在具体的实施方式中，所述吖啶类化学发光物质为吖啶酯或其衍生物，优选为吖啶酯。在优选的实施方式中，所述抗孕酮抗体为鼠源单克隆抗体。在优选的实施方式中，所述样本可为血清、肝素血浆、EDTA血浆。在具体的实施方式中，通过测定发光信号值来获得样本中孕酮的浓度。在第二方面，本专利技术提供了一种用于检测孕酮的试剂盒，包括：孕酮或其衍生物，所述孕酮或其衍生物经水溶性生物素修饰；抗孕酮抗体，所述抗体经吖啶类化学发光物质标记；和链酶亲和素微粒。在优选的实施方式中，所述链霉亲和素微粒为链酶亲和素蛋白包被的磁微粒。在优选的实施方式中，所述链酶亲和素微粒的粒径约为1～3μm，更优选约为1μm。在具体的实施方式中，所述吖啶类化学发光物质为吖啶酯或其衍生物，优选为吖啶酯。在优选的实施方式中，所述抗孕酮抗体为鼠源单克隆抗体。本专利技术的有益效果在于提高了孕酮测定试剂盒的灵敏度和稳定性。附图说明图1示出了本专利技术方法的实验原理；图2示出了使用Roche公司的ProgesteroneIII测定孕酮时的实验原理；图3示出了使用本专利技术的方法及比较例2的方法(Roche-AE法)测定孕酮校准品时的结果；具体实施方式目前，用于测定孕酮的商品化吖啶类化学发光试剂中存在着易产生空间位阻效应以及孕酮衍生物稳定性差的问题，这些情况或多或少地会影响最终的测定效果。为了改善空间位阻效应及孕酮衍生物的稳定性以使孕酮的测定效果更为理想，本专利技术人尝试对已有的吖啶类化学发光分析方法进行调整，然而大多数调整方式均未取得更为理想的效果。在大量研究的基础上，本专利技术人意外发现了“先用水溶性生物素修饰的孕酮衍生物与样本中的孕酮竞争结合吖啶标记抗体；再加入链酶亲和素磁微粒与生物素修饰孕酮衍生物结合”这一测定方式在改善空间位阻效应及孕酮衍生物稳定性的同时获得了更为理想的测定效果。在免疫检测领域中，已存在利用生物素和链酶亲和素体系的分析方法，例如，Roche公司的ProgesteroneIII采用了一种电化学发光分析方法：先将样本与生物素化的孕酮抗体结合，再加入链酶亲和素磁微粒和三联吡啶钌标记的孕酮衍生物反应(图2示出了上述方法的实验原理)。一方面，由于采用三联吡啶钌标记孕酮衍生物，故理论上应不存在因微粒所导致的空间位阻效应及孕酮衍生物聚集的问题；另一方面，与本专利技术的方法相同，该方法也是利用孕酮衍生物与样本中的孕酮竞争结合抗孕酮抗体，即两者均属于竞争法。在此基础上，我们尝试将Roche公司的孕酮测定方法中的三联吡啶钌替换为吖啶类物质(下文中称为Roche-AE法)，并预期替换后的方法的测定效果将与本专利技术的方法相似。然而令人惊奇的是：虽然同样使用吖啶酯发光分析、基于竞争法的实验原理并同样使用了链酶亲和素和生物素体系，本专利技术的方法在灵敏度、稳定性方面却明显优于Roche-AE法(详见下文实施例3～4)。据此，本专利技术提供了一种测定孕酮的方法和试剂盒，其克服了目前商品化试剂中存在的空间位阻效应及孕酮衍生物聚集的问题，同时该方法和试剂取得了出人意料的测定效果。下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本专利技术，本专利技术的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本专利技术，而非限制本专利技术。在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。链酶亲和素微粒在本专利技术中，“链酶亲和素微粒”还可称为“链酶亲和素粒子”和“链酶亲和素珠”，是指链霉亲和素微粒为链酶亲和素蛋白包被的微粒，具体是将链酶亲和素蛋白共价偶联于甲苯黄酰化微粒或羧基微粒上，其粒径通常在1.0～3.0μm范围内。常见的链酶亲和素微粒可为链酶亲和素蛋白包被的磁性微粒，如购置为ThermoFisher的MyOneTM链酶亲和素T1/C1、M-280链霉亲和素；购置为JSRLifeSciences公司的MagnosphereTMMS300/Streptavidin，但本专利技术不限于此。水溶性生物素修饰的孕酮本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种测定孕酮的方法，包括：1)将样本与水溶性生物素修饰的孕酮或其衍生物以及抗孕酮抗体混合孵育，其中，所述抗孕酮抗体经吖啶类化学发光物质标记；2)加入链霉亲和素微粒；以及3)获得样本中孕酮的浓度。

【技术特征摘要】
1.一种测定孕酮的方法，包括：1)将样本与水溶性生物素修饰的孕酮或其衍生物以及抗孕酮抗体混合孵育，其中，所述抗孕酮抗体经吖啶类化学发光物质标记；2)加入链霉亲和素微粒；以及3)获得样本中孕酮的浓度。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述链霉亲和素微粒为链酶亲和素磁微粒，优选的，其粒径在1～3μm范围内。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述吖啶类化学发光物质为吖啶酯及其衍生物。4.根据权利要求1所述的方法，其中，水溶性生物素为带有-PEGn-、-SO3-和/或甜菜碱的生物素，其中，n＝1～10。5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样本为血清或血...

【专利技术属性】
技术研发人员：席强，张凌燕，田君喜，
申请(专利权)人：迈克生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51