特异性针对卵形鲳鲹神经坏死病毒的核酸适配体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种特异性针对卵形鲳鲹神经坏死病毒的ssDNA核酸适配体及其应用，所述ssDNA核酸适配体的核苷酸序列为5’‑GTCTGAAGTAGACGCAGGAGAACTGTATTAGCCTCTGGGTGCCGCACCGTAGTGCCCTATCTAACATCACAGTCACACCTGAGTAAGCGT‑3’(SEQ ID NO:1)或5’‑AACTGTATTAGCCTCTGGGTGCCGCACCGTAGTGCCCTATCTAACATCAC‑3’(SEQ ID NO:2)。本发明专利技术的ssDNA核酸适配体对卵形鲳鲹源神经坏死病毒感染细胞具有特异性和高灵敏度，且无免疫原性。该ssDNA核酸适配体高特异性、高亲和性、无细胞毒性、稳定易修饰、便于合成和保存，可对卵形鲳鲹源神经坏死病毒感染细胞进行快速准确的检测和诊断。

Nucleic acid aptamers specifically targeting neuronecrosis virus of pomfret and their application

The invention discloses a ssDNA nucleic acid adapter specifically targeting the neuronecrosis virus of Egg breabream, and its application. The nuclenucleotide sequence of the ssDNA nucleic acid adapter is 5'GTCTGAAGTAGTAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGACCTCTCTCGGGGGGGGCACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCATATATATATATATCATCAATCACACACACACACACACACGGGGGCACACACACACATCTCTCTCACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACCATCAC 3'(SEQ ID) NO:2). The ssDNA nucleic acid adapter of the invention has specificity and high sensitivity to the infected cells of the oval pomfret-derived neuronecrosis virus, and has no immunogenicity. The ssDNA aptamer has high specificity, high affinity, no cytotoxicity, stability, easy modification, easy synthesis and preservation, and can be used for rapid and accurate detection and diagnosis of neuronecrosis virus-infected cells from pomfret.

【技术实现步骤摘要】
特异性针对卵形鲳鲹神经坏死病毒的核酸适配体及其应用
本专利技术涉及一种ssDNA核酸适配体及其筛选方法、检测方法和应用，特别是涉及一种特异性针对卵形鲳鲹神经坏死病毒的核酸适配体及其应用。
技术介绍
我国作为水产养殖大国，水产养殖量占世界水产品养殖总量的70％。广西是我国的水产养殖大省，主要养殖品种包括卵形鲳鲹、草鱼、斑点叉尾鮰、石斑鱼、对虾、牡蛎、马氏珠母贝和各种食用植物。然而，随着城市化、工业化、养殖规模化进程的加快，广西水产养殖环境日益恶化，各种病害频繁暴发，造成了巨大经济损失。2017年广西北海近海网箱养殖的卵形鲳鲹暴发病毒性神经坏死鱼病，通过对患病卵形鲳鲹中病原微生物进行鉴定，分离获得卵形鲳鲹源神经坏死病毒，并将其命名为GuangxiTrachinotusovatusnervousnecrosisvirus(GTONNV)。据报道。神经坏死症病毒会导致鱼类的脑组织和眼睛视网膜组织细胞空泡化，特别是对苗种生产期的仔鱼和幼鱼危害很大，爆发速度快，致死率高达95％-100％。根据“预防为主，防治结合”的病害防控原则，在神经坏死病毒感染早期阶段，通过快速检测、精确诊断，迅速有的放矢地施行高效防控措施，对于控制病毒的大规模爆发流行至关重要。但是目前针对鱼类神经坏死病毒的诊断方法主要是聚合酶链式反应检测技术(polymerasechainreation,PCR)等。PCR检测结果精确可靠，但却存在操作繁琐、耗时长、仪器试剂昂贵等不足，无法满足现场快速准确检测诊断的要求。因此应着力发展操作便捷、成本低、耗时短、准确度高、可用于养殖现场的卵形鲳鲹源神经坏死病毒快速检测技术，这对于及早发现、确定病原，进而有的放矢地制定治疗方案来控制病原扩散、降低损失至关重要。指数富集的配基系统进化技术(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichmenttechnology,SELEX)是一种生物文库筛选技术，该技术使用容量高达1014-1015的随机寡核苷酸文库，在体外经过多轮筛选最终获得能够特异性识别靶物质的单链寡核苷酸，即核酸适配体。核酸适配体具有易筛选获得、成本低、易修饰、稳定性强、高特异性识别并结合靶物质等诸多优点，目前已发展成为一类广受关注的新型检测和治疗工具，其在重大疾病的生物医学基础研究、疾病诊断领域同样显示出广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术在于提供一种高特异性、高灵敏度、无免疫原性、且稳定易修饰、便于合成和保存的用于检测卵形鲳鲹源神经坏死病毒的ssDNA核酸适配体，以至少解决现有的生物学检测技术不能在现场快速对卵形鲳鲹源神经坏死病毒进行准确检测和诊断的问题。本专利技术的目地在于提供一种可特异性识别神经坏死病毒的ssDNA核酸适配体，所述ssDNA核酸适配体的核苷酸序列为5’-GTCTGAAGTAGACGCAGGAGAACTGTATTAGCCTCTGGGTGCCGCACCGTAGTGCCCTATCTAACATCACAGTCACACCTGAGTAAGCGT-3’(SEQIDNO:1)或5’-AACTGTATTAGCCTCTGGGTGCCGCACCGTAGTGCCCTATCTAACATCAC-3’(SEQIDNO:2)。进一步地，所述ssDNA核酸适配体的核苷酸序列上任一位置能进行磷酸化、巯基化、甲基化、氨基化或同位素化反应。更进一步地，所述ssDNA核酸适配体的核苷酸序列上结合有标记物。更进一步地，所述标记物选自生物素、酶、发光基团中的一种或多种。更进一步地，所述发光基团选自异硫氰酸荧光素、羧基四甲基罗丹明、羟基荧光素中的一种或多种。本专利技术的另一目地在于提供一种上述ssDNA核酸适配体的筛选方法，包括以下步骤：步骤1：合成以下序列所示的单链DNA文库和引物：随机文库Library50：5’-GTCTGAAGTAGACGCAGGAG(50N)AGTCACACCTGAGTAAGCGT5’引物：5’-FAM-GTCTGAAGTAGACGCAGGAG-3’；3’引物：5’-Biotin-ACGCTTACTCAGGTGTGACT-3’；步骤2：取10nmol上述随机文库溶解于500μlPBS中，在92℃下恒温水浴5min，然后迅速进行冰浴，冰浴10min，取处理后的随机文库与GTONNV感染细胞在冰上孵育1h；待孵育结合完成后，离心并除去上清，取10mL的PBS洗涤GTONNV感染细胞，并在92℃下恒温水浴10min，在12000g的条件下离心1-20min，并收集上清液，所述上清液即为特异性识别GTONNV感染细胞的ssDNA核酸适配体库；步骤3：取100ul筛选得到的识别GTONNV感染细胞的ssDNA核酸适配体库进行PCR扩增，具体的扩增条程序为：94℃5min，94℃1min，56℃30sec，72℃1min，经过20轮循环，72℃5min；步骤4：将100μl链酶亲和素标记的磁珠与步骤3中PCR扩增所得的双链DNA在常温下孵育20min，利用双链DNA上的生物素与磁珠上链酶亲和素的亲和作用，将双链DNA结合到磁珠表面，利用磁性分离器上除去上清，用2mLPBS洗涤磁珠，然后在EP管中加入200ulNaOH溶液(200mM)，常温反应10min，利用磁性分离架回收得到上清；步骤5：取步骤4所得上清液加入无菌水洗涤后除盐柱进行盐分分离，在重力作用下自然滴完，向收集到的液体中加入500μlPBS，得到含有DNA单链文库的溶液；步骤6：取步骤5中得到的DNA单链文库代替步骤2中的随机文库，并将步骤2-5重复8次；步骤7：取步骤6的筛选得到的DNA文库溶解、92℃恒温水浴、冰浴后，与卵形鲳鲹正常细胞在冰上孵育1h，孵育完成后离心收集上清溶液；然后将此上清溶液与卵形鲳鲹正常细胞进行冰浴结合；孵育结合完成后，收集上清，收集到的上清即为经过阴性筛选的核酸文库库；步骤8：取步骤7中所得上清溶液，依次按照步骤3、步骤4、步骤5、步骤7、步骤2、步骤3、步骤4和步骤5的实验操作顺序重复8次，最终所得溶液为ssDNA核酸适配体。本专利技术的另一目地在于提供一种应用上述ssDNA核酸适配体的卵形鲳鲹源神经坏死病毒的快速检测方法(AFMP)，包括以下步骤：步骤1：对ssDNA核酸适配体进行生物素标记；步骤2：取待测样品1-100mg与步骤1所得浓度为100-200nM的ssDNA核酸适配体混合，并在冰上孵育结合40min，1000g离心去上清；待孵育结合后，清洗待测样品，混匀在200μlPBS溶液中，使用流式细胞仪进行检测，根据荧光值的变化检测待测样品中是否有卵形鲳鲹源神经坏死病毒感染细胞。本专利技术还有一目地在于提供一种应用上述ssDNA核酸适配体在检测卵形鲳鲹源神经坏死病毒中的用途。本专利技术通过SELEX技术筛选得到的核酸适配体，与现有的蛋白抗体相比具有更高的亲和力和特异性，而且还具有蛋白抗体所不具备的特点，包括无免疫原性；制备周期短，重现性好；分子量小，便于体外化学合成；便于标记；易于对核酸适配体的不同部位进行修饰和取代；序列稳定易于运输和保存等。采用本专利技术的基于核酸适配体的卵形鲳鲹源神经坏死病毒的快速检测方法(AFMP)对鱼类神经坏死病毒进行检测时，操作简单迅速，可结合酶标仪、流式细胞仪本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种ssDNA核酸适配体，其特征在于，所述ssDNA核酸适配体的核苷酸序列为5’‑GTCTGAAGTAGACGCAGGAGAACTGTATTAGCCTCTGGGTGCCGCACCGTAGTGCCCTATCTAACATCACAGTCACACCTGAGTAAGCGT‑3’(SEQ ID NO:1)。

【技术特征摘要】
1.一种ssDNA核酸适配体，其特征在于，所述ssDNA核酸适配体的核苷酸序列为5’-GTCTGAAGTAGACGCAGGAGAACTGTATTAGCCTCTGGGTGCCGCACCGTAGTGCCCTATCTAACATCACAGTCACACCTGAGTAAGCGT-3’(SEQIDNO:1)。2.一种ssDNA核酸适配体，其特征在于，所述ssDNA核酸适配体的核苷酸序列为5’-AACTGTATTAGCCTCTGGGTGCCGCACCGTAGTGCCCTATCTAACATCAC-3’(SEQIDNO:2)。3.根据权利要求1或2所述的ssDNA核酸适配体，其特征在于，所述ssDNA核酸适配体的核苷酸序列上任一位置能进行磷酸化、巯基化、甲基化、氨基化或同位素化反应。4.根据权利要求1或2所述的ssDNA核酸适配体，其特征在于，所述ssDNA核酸适配体的核苷酸序列上结合有标记物。5.根据权利要求4所述的ssDNA核酸适配体，其特征在于，所述标记物选自生物素、酶、发光基团中的一种或多种。6.根据权利要求5所述的ssDNA核酸适配体，其特征在于，所述发光基团选自异硫氰酸荧光素、羧基四甲基罗丹明、羟基荧光素中的一种或多种。7.一种如权利要求1或2所述ssDNA核酸适配体的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：合成以下序列所示的单链DNA文库和引物：随机文库Library50：5’-GTCTGAAGTAGACGCAGGAG(50N)AGTCACACCTGAGTAAGCGT5’引物：5’-FAM-GTCTGAAGTAGACGCAGGAG-3’；3’引物：5’-Biotin-ACGCTTACTCAGGTGTGACT-3’；步骤2：取10nmol上述随机文库溶解于500μlPBS中，在92℃下恒温水浴5min，然后迅速进行冰浴，冰浴10min，取处理后的随机文库与GTONNV感染细胞在冰上孵育1h；待孵育结合完成后，离心并除去上清，取10mL的PBS洗涤GTONNV感染细胞，并在92℃下恒温水浴10min，在12000g的条件下离心1-20min，并收集上清液，所述上...

【专利技术属性】
技术研发人员：李鹏飞，余庆，刘明珠，李菲，吴思婷，肖贺贺，
申请(专利权)人：广西科学院，
类型：发明
国别省市：广西,45