一种快速区分PCV2、PCV3和Mhp的多重PCR检测引物组及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开一种快速区分PCV2、PCV3和Mhp的多重PCR检测引物组及试剂盒，属于动物病学和分子生物学技术领域。该试剂盒包括SEQ ID1‑6所示的引物序列，还包括10×Multi HoeStart Buffer、Super Pure dNTPs、Multi HoeStart DNA Polymerase、模板和灭菌水。本发明专利技术提供的PCV2、PCV3和Mhp的多重PCR检测试剂盒采用多重PCR扩增，为三种猪呼吸道疾病的一次检测，其检测方法易于操作、方便快捷，能达到快速检测的目的。

【技术实现步骤摘要】
一种快速区分PCV2、PCV3和Mhp的多重PCR检测引物组及试剂盒
本专利技术属于动物病学和分子生物学
，具体为针对PCV2、PCV3和Mhp的多重PCR的检测引物组、检测试剂盒及应用。
技术介绍
猪圆环病毒（Porcinecircovirus，PCV）为一种共价闭合、单股环状DNA病毒，是迄今发现最小动物病毒。2015年前，全球范围内仅发现PCV1和PCV2两个基因型。其中，PCV1被认为是猪肾细胞PK-15污染物，但不产生细胞病变效应，对猪无致病性。PCV2是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）主要病原，与猪皮炎和肾病综合征（PDNS）、猪呼吸道疾病综合征（PRDC）、繁殖障碍、增生性坏死性肺炎（PNP）和肠炎等疾病密切相关，均为猪圆环病毒相关疾病（PCVAD）。临床上PCV2常与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)和猪肺炎支原体(MHp)等病原体混合感染。同时，感染PCV2后还容易继发细菌感染，给养猪业造成巨大经济损失。猪圆环病毒3型(Porcinecircovirustype3，PCV3)，分类上属于圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属（Circovirus），根据国际病毒分类委员会(ICTV)的分类标准PCV3为猪圆环病毒（Porcinecircovirus，PCV）的新成员。2016年，美国首次报道从发生繁殖障碍和呼吸道疾病的3周龄的病猪中分离到了该病毒。随后相继被波兰、韩国和中国等国家报道，并在世界范围内迅速蔓延，引起了各国的高度重视和密切关注。PCV3感染可引起猪的皮炎、肾病综合征、呼吸系统疾病、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应等，给全世界的生猪养殖造成了极大的经济损失。猪支原体肺炎(Mycoplasmalpneumoniaofswine,MPS)是以哮喘和气喘为主要症状的慢性呼吸道传染病，具有高度接触性、高传染性及高发病率等特征。该病主要是由猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)引起的。猪肺炎支原体可以明显降低感染动物的生长率和饲料转化率，造成大量的经济损失。同时损伤被感染动物的机体免疫力，形成系统性免疫抑制，从而使被感染动物更容易感染其它病原体，大大增加了目前猪病防控及诊断的工作难度。PCV2、PCV3和Mhp的都能引起感染猪猪呼吸道疾病，同时三者也均为免疫抑制性疾病，感染后能继发感染多种病毒或细菌性疾病，使疫情更加严重和难以诊断，给养猪业带来更加巨大的经济损失。因此，有必要建立一种能够同时快速检测PCV2、PCV3和Mhp多重PCR检测方法，为临床上及时准确地对猪呼吸道疾病进行调查和监测提供技术支持，从而有效地防控猪呼吸道疾病的发生与流行。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决上述技术问题，提供一种快速区分PCV2、PCV3和Mhp的多重PCR检测引物组及试剂盒，该试剂盒能够快速区分PCV2、PCV3和Mhp，灵敏感高、特异性强，从而为有效防控PCV2、PCV3和Mhp三种猪呼吸道疾病的发生和流行提供技术支持。为实现本专利技术目的所使用的技术方案为：一种快速区分PCV2、PCV3和Mhp的多重PCR检测引物组，所述多重PCR检测引物组由PCV2PCR检测引物对、PCV3PCR检测引物对和MhpPCR检测引物对组成；所述PCV2PCR检测引物对由具有SEQIDNO:1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQIDNO:2所示核苷酸序列的下游引物组成；所述PCV3PCR检测引物对由具有SEQIDNO:3所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQIDNO:4所示核苷酸序列的下游引物组成；所述MhpPCR检测引物对由具有SEQIDNO:5所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQIDNO:6所示核苷酸序列的下游引物组成。优选地，所述PCV2PCR检测引物对是依据PCV2的全基因进行设计，扩增目的片段大小为1152bp；所述PCV3PCR检测引物对是依据PCV3的全基因进行设计，扩增目的片段大小为395bp；所述MhpPCR检测引物对是Mhp的全基因进行设计，扩增目的片段大小为649bp。优选地，所述多重PCR检测引物组在制备猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型和猪支原体肺炎鉴别检测试剂盒的应用。一种如以上所述快速区分PCV2、PCV3和Mhp的多重PCR检测试剂盒，所述多重PCR检测试剂盒包括具有SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5所示核苷酸序列的上游引物以及具有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6所示核苷酸序列的下游引物。优选地，所述的多重PCR检测试剂盒还包括10×MultiHoeStartBuffer、SuperPuredNTPs、MultiHoeStartDNAPolymerase、模板和灭菌水。优选地，所述的多重PCR检测试剂盒中，PCR反应体系为：PCR反应体系50µL，灭菌水28µL，10×MultiHoeStartBuffer5µL，SuperPuredNTPs4µL，25µmol/LPCV2、PCV3和Mhp上下游引物各1µL，MultiHoeStartDNAPolymerase1µL，模板6.0µL。优选地，所述的多重PCR检测试剂盒中PCR反应条件为：95℃预变性15min；94℃变性30s，60℃复性90s，72℃延伸90s，40个循环；最后72℃延伸10min。优选地，所述多重PCR检测试剂盒的最佳退火温度为60℃。优选地，所述PCR检测试剂盒的SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示引物使用浓度为25μmol/L。本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的PCV2、PCV3和Mhp的多重PCR检测试剂盒采用多重PCR扩增，为三种猪呼吸道疾病的一次检测，其检测方法易于操作、方便快捷，能达到快速检测的目的。本专利技术能彻底解决PCV2、PCV3和Mhp引起的类似症状但病原不同的诊断问题，适合猪场快速检测，亦适用于流行病学调查。本专利技术提供了三对针对PCV2、PCV3和Mhp的特异性引物，PCV2-P1/PCV2-P2为PCV2特异性扩增引物组，PCV3-P1/PCV3-P2为PCV3特异性扩增引物组，Mhp-P1/Mhp-P2为Mhp特异性扩增引物组，利用其制成的多重PCR检测试剂盒能快速、特异的检测出PCV2、PCV3和Mhp中的单一病毒或细菌以及三者的混合病毒和细菌，PCV2出现1152bp一个条带，PCV3出现395bp一个条带，Mhp出现649bp一个条带，PCV2、PCV3、Mhp三阳性样品出现1152bp、395bp、649bp三个条带。本专利技术的PCV2、PCV3和Mhp的多重PCR检测试剂盒对PCV2的检测极限为1.03×10-6µg/µL，对PCV3的检测极限为0.62×10-6µg/µL，对Mhp的检测极限为0.7×10-6µg/µL，表明本专利技术的PCV2、PCV3和Mhp的多重PCR检测试剂盒在检测PCV2、PCV3和Mhp时具有较高的灵敏度。本专利技术的PCV2、PCV3和MhpPCR鉴别检测试剂盒既能缩短诊断时间、节约诊断试剂，又能降低使用成本。本专利技术提供的PCV2、PCV3和MhpP本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速区分PCV2、PCV3和Mhp的多重PCR检测引物组，其特征在于，所述多重PCR检测引物组由PCV2 PCR检测引物对、PCV3 PCR检测引物对和Mhp PCR检测引物对组成；所述PCV2 PCR检测引物对由具有SEQ ID NO:1 所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:2 所示核苷酸序列的下游引物组成；所述PCV3 PCR检测引物对由具有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:4 所示核苷酸序列的下游引物组成；所述Mhp PCR检测引物对由具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:6 所示核苷酸序列的下游引物组成。

【技术特征摘要】
1.一种快速区分PCV2、PCV3和Mhp的多重PCR检测引物组，其特征在于，所述多重PCR检测引物组由PCV2PCR检测引物对、PCV3PCR检测引物对和MhpPCR检测引物对组成；所述PCV2PCR检测引物对由具有SEQIDNO:1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQIDNO:2所示核苷酸序列的下游引物组成；所述PCV3PCR检测引物对由具有SEQIDNO:3所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQIDNO:4所示核苷酸序列的下游引物组成；所述MhpPCR检测引物对由具有SEQIDNO:5所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQIDNO:6所示核苷酸序列的下游引物组成。2.根据权利要求1所述快速区分PCV2、PCV3和Mhp的多重PCR检测引物组，其特征在于，所述PCV2PCR检测引物对是依据PCV2的全基因进行设计，扩增目的片段大小为1152bp；所述PCV3PCR检测引物对是依据PCV3的全基因进行设计，扩增目的片段大小为395bp；所述MhpPCR检测引物对是Mhp的全基因进行设计，扩增目的片段大小为649bp。3.根据权利要求1所述快速区分PCV2、PCV3和Mhp的多重PCR检测引物组，其特征在于，所述多重PCR检测引物组在制备猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型和猪支原体肺炎鉴别检测试剂盒的应用。4.一种如权利要求1所述快速区分PCV2、PCV3和Mhp的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述多重PCR检测试剂盒包括具有SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5所示核苷酸序列的上游引物以及具有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘磊，段群棚，周英宁，赵武，李斌，何颖，秦毅斌，卢冰霞，陈忠伟，张宁，梁家幸，苏乾莲，蓝常力，冯建远，蒋冬福，卢敬专，郭旋，
申请(专利权)人：广西壮族自治区兽医研究所，
类型：发明
国别省市：广西,45