一种猪流行性腹泻病毒的反转录聚合酶螺旋反应等温检测试剂及检测方法技术

本发明专利技术属于病毒检测技术领域，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒的反转录聚合酶螺旋扩增等温检测方法(Reverse transcription polymerase spiral reaction，RT‑PSR)。本发明专利技术提供了一套完整的猪流行性腹泻病毒聚合酶螺旋检测方法，包括检测试剂和反应条件，根据基因保守区设计合成一对特异性引物，包括上游引物S3、下游引物S4，检测试剂包括如下组分：10×Bst Buffer反应缓冲液、dNTPs、MgSO4、Bst DNA聚合酶、AMV反转录酶、DEPC水、显色试剂和上述引物。本发明专利技术提供的检测方法在应用时具有特异性强、灵敏性高、操作简便、成本低廉等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种猪流行性腹泻病毒的反转录聚合酶螺旋反应等温检测试剂及检测方法
本专利技术属于病毒检测
，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒的反转录聚合酶螺旋反应(reversetranscriptionpolymerasespiralreaction，RT-PSR)等温检测试剂及检测方法。
技术介绍
猪流行性腹泻(Porcineepidemicdiarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)引起的，病毒粒子呈圆形或椭圆形，属于冠状病毒科，表面有囊膜，囊膜上有放射状纤突，囊膜内为核衣壳蛋白与RNA形成的蜷曲缠绕状结构。PEDV能够引起各个年龄阶段的猪感染，临床症状与传染性和胃肠炎病毒(TGEV)引起的症状类似，主要包括腹泻、呕吐、严实4、脱水及体重减轻等，仔猪的临床症状较为严重，出现大量的死亡，死亡率最高可达100％，给养猪业带来巨大的经济损失。PEDV的爆发首先在英国被报道，CV777毒株在比利时被分离发现，1978年被认为是造成比利时爆发PED的元凶，证实了区别于TGEV的存在，在1982年，被证实命名为PEDV，此后的40年里，PEDV在欧洲、亚洲、美洲等众多养猪国家相继爆发，并造成相当大的经济损失。在亚洲，我国在1973年就有关于PED的报道，描述了类似于临床症状的一种疾病，但直到1984年引起这种疾病的病原才被分离发现。2010年之前，尽管PED在我国时有发生，但呈现散发性和区域性特点。2010年我国南部省份爆发了高致病的PED，并迅速蔓延至全国，仔猪的死亡率高达100％。在日本，首先检测到PED是在1982年，且在2013年，高致病性PED在日本爆发。1992年，在韩国报道出现PED，2004-2013年PED在韩国得到控制，未出现大范围的爆发。但在2013年，韩国出现了高致病性毒株的爆发。在亚洲其他地区如：泰国、菲律宾等也有PED的相关报道，且在2013年前后相继爆发高致病性PED。PED的流行通常表现为对新生哺乳仔猪易感，且造成严重的后果，同时，PED还与其他致病源共感染，例如：大肠杆菌感染、猪圆环病毒2型TGEV和轮状病毒。新生仔猪体重减轻、水样腹泻、呕吐、脱水、高死亡率，粪便呈黄白色有酸臭味是PED的典型症状。组织学病变包括急性、弥漫性、严重的萎缩性肠炎，浅表上皮细胞的轻度空泡化及结肠、盲肠的上皮水肿；急性感染期间，在空肠的绒毛尖端或整个绒毛上观察到空泡化的细胞或大块细胞剥落，萎缩的绒毛通常与退化或再生的扁平上皮融合及覆盖在上面，在固有层细胞中有明显的炎性细胞浸润。PEDV感染的的早期(即潜伏期)感染猪表现出正常的绒毛长度，但空泡状细胞坏死已经开始出现；腹泻发生后的1-3天，受感染的猪表现出严重的绒毛缩短；感染后期(临床症状出现后84-120h)持续的细胞坏死导致中度到重度的绒毛萎缩。PEDV主要编码4中结构蛋白S、E、M、N，这几种蛋白构成病毒粒子的基本结构，并在病毒的复制、扩增中发挥重要的作用。除结构蛋白外，在病毒复制、装配过程中多种非结构蛋白同时发挥着重要的作用。PEDV上的ORF1a及ORF1b编码的非结构蛋白，多聚蛋白pp1a和pp1b。多聚蛋白在多种酶的作用下被切割成16种成熟的复制酶，这些酶一般被称为非结构蛋白，被命名为NSP1-NSP16，他们的主要功能是参与RNA的合成、病毒的复制及病毒与宿主之间的反应。ORF3位于S基因和E基因之间，编码一种非结构辅助蛋白，这种蛋白是一个离子通道蛋白，能够提高病毒的产量影响病毒粒子的释放和致病力，研究表明缺失ORF3蛋白可能导致病毒毒力减弱；目前市场上所有的疫苗株中，ORF3在相似的部位均存在缺失，因此，ORF3可以作为区分强弱毒株的一个标志，用于临床诊断和流行病学调查。目前PEDV的诊断方法主要分为两类：病原学诊断及血清学诊断；病原学诊断主要针对病毒的核酸及蛋白，血清学诊断主要针对免疫反应后产生的抗体。近年来，由于高致病性PEDV在全球的爆发，更加快速准确的检测方法一直是人们追求的方向；同时，PEDV可以同多种疾病共同感染，且引起的临床症状相似，通过普通的手段难以区分，所以，实验室诊断技术显得尤为重要。
技术实现思路
为克服普通检测效率低、难操作、成本高的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种猪流行性腹泻病毒的反转录聚合酶螺旋反应等温检测试剂及检测方法，应用该方法进行检测时，检测时间短，特异性和敏感性高，等温反应不需要特殊仪器，操作方便且成本低。本专利技术的第一个目的是提供用于检测猪流行性腹泻病毒的反转录聚合酶螺旋反应扩增引物组，所述引物组由以下引物组成：上游引物S1：5’-tattatgttggcagcgcgtt-3’；下游引物S2：5’-tgccgtcataataagctgct-3’；上游引物S3：5’-acgaattcgtacatagaagtatag-tattatgttggcagcgcgtt-3’；下游引物S4：5’-gatatgaagatacatgcttaagca-tgccgtcataataagctgct-3’；本专利技术的第二个目的是提供一种猪流行性腹泻病毒的反转录聚合酶螺旋扩增反应等温检测试剂，所述试剂包括权利要求1所述的引物组。作为优选，所述试剂还包括如下组分：10×BstBuffer反应缓冲液、dNTPs、Mg2+、BstDNA聚合酶、AMV反转录酶、DEPC水、模板RNA和显色试剂。作为优选，所述试剂中Mg2+的浓度为6mM。作为优选，所述试剂中dNTPs的浓度为1.5mM；作为优选，所述试剂中显色试剂为酚红与甲酚红混合指示剂。作为优选，所述试剂还包括阳性对照。本专利技术的第三个目的是提供一种猪流行性腹泻病毒的反转录聚合酶螺旋扩增反应等温检测试剂盒，所述试剂盒包括上述的反转录聚合酶螺旋扩增反应等温检测试剂。本专利技术的第四个目的是提供上述等温检测试剂或等温检测试剂盒在如下任一中的应用：(1)不以疾病的诊断和治疗为目的的检测或辅助检测猪流行性腹泻病毒；(2)制备用于检测或辅助检测猪流行性腹泻病毒的产品；(3)不以疾病的诊断和治疗为目的的检测或辅助检测待测动物样品是否感染猪流行性腹泻病毒；(4)制备用于检测或辅助检测待测动物样品是否感染猪流行性腹泻病毒的产品；(5)不以疾病的诊断和治疗为目的的检测待测病毒是否为猪流行性腹泻病毒；(6)制备用于检测或辅助检测待测病毒是否为猪流行性腹泻病毒的产品。本专利技术的第五个目的是提供一种检测或辅助检测待测动物样品是否感染猪流行性腹泻病毒的方法，该方法不以疾病的诊断和治疗为目的，包括以下步骤：(1)从待测动物样品中提取基因组RNA作为模板，采用上述的等温检测试剂或上述的等温检测试剂盒进行反转录聚合酶螺旋反应，得到扩增产物；作为优选，所述聚合酶螺旋反应的反应条件为恒温42℃作用0.5小时，随后62℃作用1小时；(2)按照下述任一方法确定待测动物样品是否感染猪流行性腹泻病毒：A、扩增产物呈现橙黄色则待测动物样品感染猪流行性腹泻病毒；扩增产物呈现紫红色则待测动物样品未感染猪流行性腹泻病毒；B、将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条带呈梯状分布，则待测动物样品感染猪流行性腹泻病毒；仅有引物二聚体阴影带，则待测动物样品未感染猪流行性腹泻病毒。本专利技术的第六个目本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测猪流行性腹泻病毒的反转录聚合酶螺旋反应等温扩增引物组，其特征在于：所述引物组由以下引物组成：上游引物S1：5’‑tattatgttggcagcgcgtt‑3’；下游引物S2：5’‑tgccgtcataataagctgct‑3’；上游引物S3：5’‑acgaattcgtacatagaagtatag‑tattatgttggcagcgcgtt‑3’；下游引物S4：5’‑gatatgaagatacatgcttaagca‑tgccgtcataataagctgct‑3’。

【技术特征摘要】
1.用于检测猪流行性腹泻病毒的反转录聚合酶螺旋反应等温扩增引物组，其特征在于：所述引物组由以下引物组成：上游引物S1：5’-tattatgttggcagcgcgtt-3’；下游引物S2：5’-tgccgtcataataagctgct-3’；上游引物S3：5’-acgaattcgtacatagaagtatag-tattatgttggcagcgcgtt-3’；下游引物S4：5’-gatatgaagatacatgcttaagca-tgccgtcataataagctgct-3’。2.一种猪流行性腹泻病毒的反转录聚合酶螺旋扩增反应等温检测试剂，其特征在于：所述试剂包括权利要求1所述的引物组。3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于：所述试剂还包括如下组分：10×BstBuffer反应缓冲液、dNTPs、Mg2+、BstDNA聚合酶、AMV反转录酶、DEPC水、模板RNA和显色试剂。4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于：所述试剂中Mg2+的浓度为6mM。5.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于：所述试剂中dNTPs的浓度为1.5mM；作为优选，所述试剂中显色试剂为酚红与甲酚红混合指示剂。6.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于：所述试剂还包括阳性对照。7.一种猪流行性腹泻病毒的反转录聚合酶螺旋扩增反应等温检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求2-6任一项所述的反转录聚合酶螺旋扩增反应等温检测试剂。8.权利要求2-6任一项所述的等温检测试剂或权利要求7所述的等温检测试剂盒在如下任一中的应用：(1)不以疾病的诊断和治疗为目的的检测或辅助检测猪流行性腹泻病毒；(2)制备用于检测或辅助检测猪流行性腹泻病毒的产品；(3)不以疾病的诊断和治疗为目的的检测或辅助检测待测动物样品是否感染猪流行性腹泻病毒；(4)制备用于检测或辅助检测待测...

【专利技术属性】
技术研发人员：冀君，许鑫，王雪雨，李宛玉，吴倩倩，姚伦广，阚云超，
申请(专利权)人：南阳师范学院，
类型：发明
国别省市：河南,41