本发明专利技术公开了一种与蛋鸭卵泡发育相关的miRNA apla‑mir‑25‑42及其检测引物、抑制物和应用，属于基因工程技术领域。该miRNA为apla‑mir‑25‑42，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明专利技术的研究显示，该miRNA能通过靶向TGFB2基因调控卵泡发育，降低细胞增殖标记基因CyclinB2的表达，促进细胞凋亡标志基因BCL2的表达。该miRNA可以作为标志物，用于检测蛋鸭卵泡颗粒细胞增殖分化状况；弥补了本领域现有的空缺，为解析蛋鸭卵泡发育的遗传机理提供理论基础和科学依据，对于研究蛋鸭繁殖性状的遗传本质、提高蛋鸭繁殖力以及遗传辅助育种都具有重要的意义。
【技术实现步骤摘要】
与蛋鸭卵泡发育相关的miRNAapla-mir-25-42及其检测引物、抑制物和应用
本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及与蛋鸭卵泡发育相关的miRNAapla-mir-25-42以及检测引物、抑制物和应用。
技术介绍
卵泡发育与蛋鸭的产蛋性能密切相关，直接影响蛋鸭的产蛋量。已有研究表明，禽类卵泡发育是极为复杂的生物学过程，目前人们已对家禽的卵泡发育模式有了一定的了解，但是作为决定产蛋量的重要因素，卵泡发育的具体调控机理仍需深入研究。然而目前，缺乏检测蛋鸭的卵泡发育状况的miRNA标志物。鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺陷与不足，本专利技术的目的包括但不限于提供一种与蛋鸭卵泡发育相关的miRNA。该miRNA可以作为标志物，用于检测蛋鸭卵泡颗粒细胞增殖分化状况，为判断目标蛋鸭的产蛋性能提供参考。本专利技术的另一个目的包括但不限于提供上述miRNA的应用。本专利技术的另一个目的包括但不限于提供上述miRNA的检测引物。本专利技术的另一个目的包括但不限于提供一种抑制上述miRNA结合至其靶基因的抑制物。本专利技术的另一个目的包括但不限于提供一种重组表达载体。本专利技术的另一个目的包括但不限于提供一种调控蛋鸭卵泡发育的方法。为实现上述目的，本专利技术通过下述技术方案实现:随着“基因组时代”的来临，在全基因组水平上解析性状相关基因表达模式的整体特征，以揭示蛋鸭产蛋表型性状形成的分子基础是今后蛋鸭育种工作的重要研究方向之一。microRNA(miRNA)作为一类小的单链内源性非编码RNA，能够通过降解靶mRNA或抑制翻译发挥其基因转录后的调控作用。近年来，大量研究表明，miRNAs在细胞分化与凋亡、生长发育、糖脂代谢、炎症、免疫应答以及肿瘤发生等多个生理和病理过程中均扮演着关键的角色，其中在卵泡发育过程中一些影响卵泡颗粒细胞分化和增殖的miRNA已经被筛选和确定。颗粒细胞的生长状况直接影响到卵泡的发育情况，卵泡颗粒细胞可以分泌性腺激素及生长因子调控卵泡膜细胞和卵母细胞的生长、分化和成熟，同时也精确的调控卵泡的生长发育。因此，保障良好的卵泡发育、掌握卵泡发育的调控规律有助于进一步提高蛋鸭的繁殖力，对于提高蛋鸭生产性能具有重要意义。然而目前关于蛋鸭组织特异性miRNA的研究尤其是蛋鸭卵泡miRNA及其调控机制的研究尚未见报道。因此，迫切需要提高蛋鸭卵泡miRNA研究水平和完整性，从而为蛋鸭基因组及其非编码RNA的研究提供科学的理论依据，以便更为深入了解蛋鸭卵泡发育的调控机制，为提高蛋鸭的繁殖性能提供理论支撑。本专利技术通过对不同发育时期两组卵泡组织样品进行高通量全转录组测序，筛选与蛋鸭卵泡发育相关的miRNA，经过生物信息学差异表达分析初步选定在白卵泡中显著高表达的miRNAapla-mir-25-42，其能通过靶向TGFB2基因调控卵泡发育，促进细胞增殖标记基因CyclinB2的表达，抑制细胞凋亡标志基因BCL2的表达。该miRNA对研究蛋鸭繁殖性状的遗传本质及提高蛋鸭繁殖力具有重要的意义，其具有重要的实际应用价值。基于此，在本专利技术的第一方面，提供了一种与蛋鸭卵泡发育相关的miRNA，所述miRNA为apla-mir-25-42，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。在本专利技术的第二方面，提供了上述的与蛋鸭卵泡发育相关的miRNA作为分子标志物在检测蛋鸭卵泡颗粒细胞增殖分化状况中的应用。经过研究，本专利技术提供的miRNA即apla-mir-25-42分子在蛋鸭白卵泡中的表达量极显著高于蛋鸭黄卵泡中的表达量(P<0.01)，首次发现蛋鸭apla-mir-25-42与蛋鸭卵泡发育相关，由此本专利技术的蛋鸭apla-mir-25-42可作为分子标志物用于鉴别蛋鸭卵泡的发育情况例如卵泡颗粒细胞的增殖分化状况，弥补了本领域现有的空缺，为解析蛋鸭卵泡发育的遗传机理提供理论基础和科学依据；此外，其对于研究蛋鸭繁殖性状的遗传本质、提高蛋鸭繁殖力以及遗传辅助育种都具有重要的意义。在本专利技术的第三方面，提供了检测上述miRNA的引物。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，所述引物包括SEQIDNO:2所示的上游引物、SEQIDNO:3所示的下游引物和SEQIDNO:5所示的LOOP引物。在本专利技术的第四方面，提供了一种能抑制上述的与蛋鸭卵泡发育相关的miRNA结合靶基因的抑制物，所述靶基因为TGFB2基因，所述抑制物与所述miRNA的结合位点为ATCCCCA；优选地，所述抑制物选自TGFB2基因的3’UTR中长约240bp区段。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，所述抑制物序列如SEQIDNO.4所示；优选地，所述抑制物的5’末端和3’末端分别添加限制性酶切位点序列；优选地，所述限制性酶切位点序列在酶切后产生粘性末端；更优选地，所述的限制性酶切位点序列分别为PmeI限制性酶切位点和XhoI限制性酶切位点对应的核苷酸序列；更优选地，所述PmeI酶切位点位于5’末端，所述XhoI酶切位点位于3’末端。在本专利技术的第五方面，提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包含如上所述的抑制物。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，所述重组表达载体中的标记基因为双荧光素酶报告基因；优选地，所述重组表达载体是通过将所述抑制物连接到报告载体pmirGLO中获得。在本专利技术的第六方面，提供了一种检测上述与蛋鸭卵泡发育相关的miRNA的试剂盒，其含有检测上述miRNA的引物组。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，所述引物组包括:反转录引物、上游引物和下游引物，反转录引物序列如SEQIDNO:5所示；上游引物序列如SEQIDNO:2所示，下游引物序列如SEQIDNO:3所示。采用该引物组，可通过茎环法检测出上述的与蛋鸭卵泡发育相关的miRNA。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，所述的试剂盒含有针对反转录试剂、反转录引物、特异性引物、内参引物、荧光定量PCR反应试剂。所述的内参引物包括U6内参基因的上游引物和下游引物，上游引物序列如SEQIDNO:6所示，下游引物序列如SEQIDNO:7所示。作为本专利技术所述试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还包括RNA提取试剂、逆转录反应体系和荧光定量PCR反应体系，其中所述荧光定量PCR反应体系包括THUNDERBIRDSYBRqPCRMix、ddH2O、所述逆转录反应体系逆转录得到的cDNA以及所述的检测引物对。作为以上具体实施方式，所述荧光定量PCR反应体系如下:THUNDERBIRDSYBRqPCRMix10μL,10uM蛋鸭apla-mir-25-42上游引物0.4μL，10uM蛋鸭apla-mir-25-42下游引物0.4μL，待检测cDNA模板2.0μL，ddH2O7.2μL，总体积20μL。在本专利技术的第七方面，提供了所述试剂盒的使用方法，包括如下步骤:步骤1、提取待检测样品中的RNA；步骤2、利用反转录引物在反转录酶的作用下进行apla-mir-25-42反转录生成cDNA；步骤3、利用如上所述的引物(例如SEQIDNO:2所示的上游引物、SEQIDNO:3所示的下游引物和SEQIDNO:5所示的LOOP引物)，对待检测样品cDNA进行荧光定量PCR扩增，采用2-ΔΔCT方法计算并获得不同来源卵泡样本中apla-本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种与蛋鸭卵泡发育相关的miRNA，其特征在于，所述miRNA为apla‑mir‑25‑42，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
【技术特征摘要】
1.一种与蛋鸭卵泡发育相关的miRNA，其特征在于，所述miRNA为apla-mir-25-42，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.如权利要求1所述的与蛋鸭卵泡发育相关的miRNA作为分子标志物在检测蛋鸭卵泡颗粒细胞增殖分化状况中的应用。3.检测如权利要求1所述的与蛋鸭卵泡发育相关的miRNA标志物的引物。4.根据权利要求3所述的引物，其特征在于，所述引物包括SEQIDNO:2所示的上游引物、SEQIDNO:3所示的下游引物和SEQIDNO:5所示的LOOP引物。5.一种抑制权利要求1所述的与蛋鸭卵泡发育相关的miRNA结合靶基因的抑制物，其特征在于，所述靶基因为TGFB2基因，所述抑制物与所述miRNA的结合位点为ATCCCCA；优选地，所述抑制物选自TGFB2基因的3’UTR中长约240bp区段。6.如权利要求5所述的抑制物，其特征在于，所述抑制物的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；优选地，所述抑制物的5’末端和3’末端分别添加限制性酶切...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴艳，肖红卫，张昊，梁振华，皮劲松，潘爱銮，蒲跃进，孙静，申杰，杜金平，白丁平，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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