一种高效转化土壤硒的菌株培养方法技术

本发明专利技术公开了一种高效转化土壤硒的菌株培养方法，包括以下步骤：S1：从富硒区采集土壤样品，称取土样加入到无菌PBS中，振荡、静置，收集土壤悬液，接着离心，得悬浮液保存备用；S2：取制备好的样品加入到液体培养基中进行筛选培养，然后制备系列稀释液，涂布到固体培养基中，培养至菌落长好，采用平板划线法获得菌株纯培养物；S3：菌株活化后接种量转接于液体培养基中，菌株进行摇床培养，将培养好的菌悬液离心，取上清液经消解反应后用原子荧光光度计测量荧光强度值，由标准曲线可得样液的硒浓度，由硒转化率公式获悉菌株的富硒能力。本发明专利技术可筛选高效、稳定的富硒微生物，为开发利用土壤硒资源提供了有效途径。

【技术实现步骤摘要】
一种高效转化土壤硒的菌株培养方法
本专利技术属于富硒
，具体涉及一种高效转化土壤硒的菌株培养方法。
技术介绍
硒是人体必需的一种微量营养元素，对人体有预防疾病、增强体质及延缓衰老等功效。广西富硒土壤面积达212万hm2，土壤硒含量最高可达2.29mg/kg，为发展富硒农产品提供了有利的基础条件。然而，广西富硒土壤多呈酸性，土壤中的硒易与铁形成难溶的复合亚硒酸铁，从而导致其有效性较低，直接影响了广西富硒土壤资源的有效利用。研究表明，土壤硒的生物有效性受环境中微生物的高度影响，微生物通过自身代谢作用可以实现硒形态、价态的转化，从而提高土壤硒的有效性。因此，筛选高效、稳定的具有硒代谢转化能力的富硒微生物，是开发利用土壤硒资源的有效途径。对土壤微生物硒耐受性进行研究，发现硒的耐受性：细菌>真菌>放线菌，土壤细菌能在高硒环境下将无机硒转化且生长良好，说明土壤细菌对硒具有较好的代谢能力。因此，本研究主要侧重于富硒土壤中细菌的分离，采用含硒培养基筛选耐硒细菌，进一步通过富硒试验获得硒转化能力强的菌株，并对其进行鉴定，以期获得硒高效转化微生物载体，为土壤硒资源利用、富硒农产品生产提供参考。
技术实现思路
本专利技术提供一种高效转化土壤硒的菌株培养方法，以解决现有筛选高效、稳定的具有硒代谢转化能力的富硒微生物存在的问题。为解决以上技术问题，本专利技术采用以下技术方案：一种高效转化土壤硒的菌株培养方法，包括以下步骤：S1：从富硒区采集土壤样品，称取土样加入到预先装有玻璃珠的无菌PBS中，接着振荡，静置，收集土壤悬液，再接着离心，沉淀用PBS悬浮，保存备用；S2：取制备好的样品加入到含硒的液体培养基中进行筛选培养，然后用梯度稀释法制备系列稀释液，取稀释液分别涂布到固体培养基中，培养至菌落长好，挑取单个菌落，采用平板划线法获得菌株纯培养物；S3：菌株活化后接种量转接于液体培养基的三角瓶中，在菌株一定量硒浓度、加硒时间及其培养时间条件下进行摇床培养，将培养好的菌悬液离心，取上清液经消解反应后用原子荧光光度计测量荧光强度值，由标准曲线可得样液的硒浓度，由硒转化率公式获悉菌株的富硒能力，从中挑选具有较强富硒能力的菌株，完成高效转化土壤硒的菌株培养。进一步地，所述的高效转化土壤硒的菌株培养方法，包括以下步骤：S1：从富硒区采集土壤样品，称取10g土样加入到预先装有10颗玻璃珠的90mL的无菌PBS中，在30℃、200r/min下振荡30min，静置5min，收集土壤悬液，于5000r/min下离心15min，沉淀用10mLPBS悬浮，在4℃下保存备用；S2：取2mL制备好的样品加入到100mL含硒浓度为100μg/mL的液体培养基中进行筛选培养，然后用梯度稀释法制备10-2～10-6系列稀释液，取100μL分别涂布到固体培养基中，在30℃下培养至菌落长好，挑取单个菌落，采用平板划线法获得菌株纯培养物；S3：菌株活化后按5％接种量转接于100mL液体培养基的三角瓶中，在菌株一定量硒浓度、加硒时间及其培养时间条件下进行摇床培养，将培养好的菌悬液在4000r/min下离心30min，取上清液经消解反应后用原子荧光光度计测量荧光强度值，由标准曲线可得样液的硒浓度，由硒转化率公式获悉菌株的富硒能力，从中挑选具有较强富硒能力的菌株，完成高效转化土壤硒的菌株培养。进一步地，步骤S2中所述液体培养基包括以下原料：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL。进一步地，所述液体培养基的pH＝7.3±0.2。进一步地，所述液体培养基在121℃下灭菌20min后使用。进一步地，步骤S2中所述固体培养基为营养琼脂。进一步地，所述固体培养基在121℃下灭菌20min后使用。进一步地，步骤S3中所述一定量硒浓度为4～8μg/mL。进一步地，步骤S3中所述加硒时间为2.5～4h。进一步地，步骤S3中所述培养时间为7～10h。本专利技术具有下述效果：(1)本专利技术可筛选高效、稳定的具有硒代谢转化能力的富硒微生物，为开发利用土壤硒资源提供了有效途径；(2)本专利技术侧重于富硒土壤中细菌的分离，采用含硒培养基筛选耐硒细菌，进一步通过富硒试验获得硒转化能力强的菌株，并对其进行鉴定，获得了硒高效转化微生物载体，为土壤硒资源利用、富硒农产品生产提供了技术支持。【附图说明】图1为耐硒细菌生长曲线图；图2为富硒细菌硒转化率图；图3为基于16SrDNA序列的系统发育树图。【具体实施方式】为便于更好地理解本专利技术，通过以下实施例加以说明，这些实施例属于本专利技术的保护范围，但不限制本专利技术的保护范围。1材料与方法1.1培养基及试剂液体培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH7.3±0.2；固体培养基：为营养琼脂，购自广东环凯微生物科技有限公司。所有培养基均在121℃灭菌20min后使用。亚硒酸钠(Na2SeO3，AR98％)购自山东西亚化学工业有限公司；磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline，PBS)购自上海生工生物工程技术服务有限公司；其他化学药品均为国内生产的分析纯产品。硒液制备：称取22.35gNa2SeO3，溶于去离子水中并定容至100mL，此溶液硒浓度为100mg/mL，使用无菌滤头(0.22μm)过滤后备用，存于避光处。使用时取上述硒液用灭菌去离子水稀释至20mg/mL。1.2菌株的分离和纯化从广西多个富硒区采集土壤样品，称取10g土样加入到预先装有10颗玻璃珠的90mL的无菌PBS中，30℃、200r/min振荡30min，静置5min，收集土壤悬液，于5000r/min离心15min，沉淀用10mLPBS悬浮，4℃保存备用。取2mL制备好的样品加入到100mL含硒浓度为100μg/mL的液体培养基中进行筛选培养，然后用梯度稀释法制备10-2～10-6系列稀释液，取100μL分别涂布到固体培养基中，30℃下培养至菌落长好，挑取单个菌落，采用平板划线法获得菌株纯培养物。1.3菌株生长曲线测定从固体培养基上挑取菌株接种于含10mL液体培养基的培养瓶中，活化后按5％接种量转接于100mL液体培养基的三角瓶中，37℃摇床培养，每隔1h取样液，用分光光度计在530nm波长下测定吸光度值，绘制菌株的生长曲线。1.4适宜硒浓度的测定按1μg/mL硒浓度梯度递增依次制备含硒量为1～20μg/mL的液体培养基，待菌株活化后，按5％接种量依次接种于上述含硒液体培养基中，37℃摇床培养，根据菌液颜色变化确定适宜硒质量浓度。1.5富硒能力测定菌株活化后按5％接种量转接于100mL液体培养基的三角瓶中，在菌株适宜硒浓度、适宜加硒时间及其合适培养时间条件下进行摇床培养。将培养好的菌悬液4000r/min离心30min，取上清液经消解反应后用原子荧光光度计测量荧光强度值，由标准曲线可得样液的硒浓度，由硒转化率公式获悉菌株的富硒能力。硒转化率(％)＝(总硒含量-残留无机硒含量)/总硒含量×100。1.6菌株的鉴定挑选具有较强富硒能力的菌株，用液体培养基活化，提取细菌基因组总DNA并以其为模板，采用细菌通用引物(27F/1492R)扩增其16SrRNA基因片段，PCR扩增产物用胶回收试剂盒进行回收纯化后在ABI3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效转化土壤硒的菌株培养方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：从富硒区采集土壤样品，称取土样加入到预先装有玻璃珠的无菌PBS中，接着振荡，静置，收集土壤悬液，再接着离心，沉淀用PBS悬浮，保存备用；S2：取制备好的样品加入到含硒的液体培养基中进行筛选培养，然后用梯度稀释法制备系列稀释液，取稀释液分别涂布到固体培养基中，培养至菌落长好，挑取单个菌落，采用平板划线法获得菌株纯培养物；S3：菌株活化后接种量转接于液体培养基的三角瓶中，在菌株一定量硒浓度、加硒时间及其培养时间条件下进行摇床培养，将培养好的菌悬液离心，取上清液经消解反应后用原子荧光光度计测量荧光强度值，由标准曲线可得样液的硒浓度，由硒转化率公式获悉菌株的富硒能力，从中挑选具有较强富硒能力的菌株，完成高效转化土壤硒的菌株培养。

【技术特征摘要】
1.一种高效转化土壤硒的菌株培养方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：从富硒区采集土壤样品，称取土样加入到预先装有玻璃珠的无菌PBS中，接着振荡，静置，收集土壤悬液，再接着离心，沉淀用PBS悬浮，保存备用；S2：取制备好的样品加入到含硒的液体培养基中进行筛选培养，然后用梯度稀释法制备系列稀释液，取稀释液分别涂布到固体培养基中，培养至菌落长好，挑取单个菌落，采用平板划线法获得菌株纯培养物；S3：菌株活化后接种量转接于液体培养基的三角瓶中，在菌株一定量硒浓度、加硒时间及其培养时间条件下进行摇床培养，将培养好的菌悬液离心，取上清液经消解反应后用原子荧光光度计测量荧光强度值，由标准曲线可得样液的硒浓度，由硒转化率公式获悉菌株的富硒能力，从中挑选具有较强富硒能力的菌株，完成高效转化土壤硒的菌株培养。2.根据权利要求1所述的高效转化土壤硒的菌株培养方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：从富硒区采集土壤样品，称取10g土样加入到预先装有10颗玻璃珠的90mL的无菌PBS中，在30℃、200r/min下振荡30min，静置5min，收集土壤悬液，于5000r/min下离心15min，沉淀用10mLPBS悬浮，在4℃下保存备用；S2：取2mL制备好的样品加入到100mL含硒浓度为100μg/mL的液体培养基中进行筛选培养，然后用梯度稀释法制备10-2～10-6系列稀释液，取100μL分别涂布到固体培养基中，在30℃下培养至菌落长好，挑取单个菌落，采用平板划线法获得菌株纯培养物；S3：...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖青，江泽普，刘永贤，邢颖，梁潘霞，潘丽萍，陈锦平，
申请(专利权)人：广西壮族自治区农业科学院农业资源与环境研究所，
类型：发明
国别省市：广西,45