一种提高枯草芽孢杆菌抗菌蛋白产量的发酵方法技术

本发明专利技术公开了一种提高枯草芽孢杆菌抗菌蛋白产量的发酵方法，先获取菌种，然后将获取的菌种先后接种到种子培养基、发酵培养基中进行发酵获得枯草芽孢杆菌抗菌蛋白，根据菌体发酵开始后前6～16小时的对数生长期和菌体发酵开始16小时后至发酵结束的稳定期生长状况按照发酵时间进行分段调整。在枯草芽孢杆菌BNCC 189983抗菌蛋白发酵过程前调控菌种接种量，发酵过程中调控体系的温度、溶氧量、pH值、摇床转速，通过以上参数的调整可使发酵前期菌种能够快速稳定的生长，发酵中后期菌种能够高效稳定的产抗菌蛋白，降低其它副产物的生成。

A Fermentation Method for Increasing the Production of Bacillus subtilis Antibacterial Protein

The invention discloses a fermentation method for increasing the output of Bacillus subtilis antimicrobial protein. The obtained strains are first obtained and then inoculated into seed medium and fermentation medium to obtain Bacillus subtilis antimicrobial protein. According to the logarithmic growth period of 6-16 hours before and after the start of fermentation and the stable period from 16 hours after the start of fermentation to the end of fermentation, the obtained strains are successively inoculated into seed medium and fermentation medium to obtain Bacillus antimicrobial The growth status was adjusted by stages according to the fermentation time. Bacillus subtilis BNCC 189983 can control the inoculation amount of bacteria before the fermentation process, and control the temperature, dissolved oxygen, pH value and shaking speed of the system during the fermentation process. By adjusting the above parameters, the bacteria can grow rapidly and steadily in the early stage of fermentation, and the bacteria in the middle and late stage of fermentation can produce antimicrobial protein efficiently and steadily, and reduce the production of other by-products.

【技术实现步骤摘要】
一种提高枯草芽孢杆菌抗菌蛋白产量的发酵方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种提高枯草芽孢杆菌抗菌蛋白产量的发酵方法。
技术介绍
芽孢杆菌作为一类重要的生防菌，可以产生各种抑菌抗菌物质拮抗植物病原菌，具有防治植物病害的潜力，也是生物防治的主要来源。其中枯草芽孢杆菌是一种自然界广泛存在、对人畜无毒无害、不污染环境、对植物病害有抑制作用的非致病性芽孢杆菌。目前，许多科研人员对枯草芽孢杆菌以及其它芽孢杆菌的病原拮抗作用及其抗菌物质的研究非常广泛。芽孢杆菌能够产生多种抑菌物质防治病害，包括细菌素、细胞壁降解酶类、抗菌蛋白、脂肤类抗生素、聚酮类化合物和多肤类化合物等。其中抗菌蛋白是具有抗真菌活性的大分子量蛋白类物质，其氨基酸残基通常在50个以上，分子量大于5kDa。研究芽孢杆菌类生防细菌产生的抗菌蛋白，一方面可以进行发酵生产，形成生物农药用于防治植物病害，替代或减少化学农药使用；另一方面枯草芽孢杆菌已经被证实可以抑制大肠癌细胞的增殖，引起细胞周期阻滞和促进细胞凋亡，并有望在将来成为一种预防肠道肿瘤发生的益生菌。某些枯草芽孢杆菌产生的果聚糖还能促进肿瘤细胞中的乙酸、丙氨酸、乳酸和磷酸的增长，通过细胞内乳酸积累来改变肿瘤细胞的生物能途径和细胞内稳态，从而表现出抗肿瘤的活性。还有研究表明枯草芽孢杆菌ZA400具有很高的纤溶酶活性并可在大肠杆菌的表达系统中克隆表达，表明它可能被应用于血栓治疗中。尽管目前枯草芽孢杆菌在应用上还存在许多问题，如产业化应用尚不成熟，商品化的药品未完全推广，并且其许多特性和作用机制尚不明确。但是，随着人们对枯草芽孢杆菌的研究逐渐深入，对其了解愈发清晰，相信在不久的将来，枯草芽孢杆菌的应用定不止于此。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于针对上述
技术介绍
中提到的研究困境，提供一种提高枯草芽孢杆菌抗菌蛋白产量的发酵方法，用于高效生产枯草芽孢杆菌BNCC189983抗菌蛋白。本专利技术采用以下技术方案：一种提高枯草芽孢杆菌抗菌蛋白产量的发酵方法，包括以下步骤：先获取枯草芽孢杆菌株，再将菌株接种到种子培养基中培养，得到种子液，然后将种子液接种到发酵培养基中发酵，在发酵过程中按对数生长期和稳定期进行分段调控发酵体系的温度、溶氧量、pH值以及摇床转速，最终后处理获得枯草芽孢杆菌抗菌蛋白产物。作为本方面进一步改进，控制菌种接种量为2～6％，优选4％。作为本方面进一步改进，接种到种子培养基中的培养具体步骤为：将枯草芽孢杆菌株接种于斜面，于36～38℃恒温培养箱中培养，然后将斜面培养基上活化后的菌株制备成菌悬液，再接种于种子培养基中，于36～38℃、200～220r/min的摇床上震荡培养12～16小时得种子液。作为本方面进一步改进，按照质量百分比计，所述种子培养基包括葡萄糖1.0％，蛋白胨1.0％，NaCl1.0％，KH2PO40.15％，MgSO4·7H2O0.15％，及余量的水；pH值为7.0。(此处相当于水为100份，各种物质的占比为质量比，其余的为水，下同。)作为本方面进一步改进，所述发酵具体步骤为：将种子液按照体积比为(4：100)～(8：100)比例接种到发酵培养基中，进行枯草芽孢杆菌的抗菌蛋白发酵。作为本方面进一步改进，按照质量百分比计，所述发酵培养基包括葡萄糖1.0％，蛋白胨1.5％，酵母浸粉1.5％，KH2PO40.1％，NaCl0.5％，MgSO4·7H2O0.15％，及余量的水；初始pH值为7.0，0.1MPa高压灭菌15min。作为本方面进一步改进，对数生长期内发酵体系温度为36～38℃，溶氧量设定为60％～80％，pH值设定为6.9～7.1，摇床转速设定为180r/min～240r/min。作为本方面进一步改进，稳定期内发酵体系温度调为34～36℃，溶氧量调整为40％～50％，pH值调整为6.6～6.8，摇床转速调整为220r/min～250r/min。作为本方面进一步改进，用乳酸和NaOH调节发酵体系的pH值。作为本方面进一步改进，所述枯草芽孢杆菌为BNCC18998枯草芽孢杆菌。通过与现有技术相比，本专利技术的优点是：本专利技术通过对枯草芽孢杆菌发酵过程菌种生长及产枯草芽孢杆菌抗菌蛋白规律的深入研究，提出了提高枯草芽孢杆菌抗菌蛋白产量的发酵方法，包括获取菌种和枯草芽孢杆菌抗菌蛋白发酵，其中，枯草芽孢杆菌抗菌蛋白发酵过程为将培养12～16小时后的菌种培养液按照体积比为4：100～8：100的比例接种到发酵培养基中制成发酵体系开始枯草芽孢杆菌抗菌蛋白发酵；在枯草芽孢杆菌抗菌蛋白的发酵过程中按时间分段调控发酵体系的温度、溶氧、pH值以及摇床转速，通过以上参数的调整可使发酵前期菌种能够快速稳定的生长，发酵中后期菌种能够高效稳定的产枯草芽孢杆菌抗菌蛋白，降低其它副产物的生成。进一步的，本专利技术工艺所述种子培养基成分包括葡萄糖1.0％，蛋白胨1.0％，NaCl1.0％，KH2PO40.15％，MgSO4·7H2O0.15％，所述种子培养基的pH值为7.0，在此营养成分(按照质量百分比计)比下，制备的发酵所用种子液中菌种的生长繁殖更快，菌种的活力达到最高。进一步的，本专利技术工艺根据产枯草芽孢杆菌抗菌蛋白菌种的生长及产素规律，提出了分段控制发酵过程参数，有效的为菌种前期生长及后期产素提供了良好的条件，很大程度上提高了枯草芽孢杆菌抗菌蛋白的生产水平，并且枯草芽孢杆菌抗菌蛋白产量稳定，发酵培养基营养配方主要原料廉价易得，节省成本，适合工业规模化生产。进一步的，本专利技术工艺菌种发酵培养基的成分为葡萄糖1.0％，蛋白胨1.5％，酵母浸粉1.5％，KH2PO40.1％，NaCl0.5％，MgSO4·7H2O0.15％；初始pH值7.0，0.1MPa高压灭菌15min。在此营养成分(按照质量百分比计)比下，枯草芽孢杆菌代谢分泌枯草芽孢杆菌BNCC189983抗菌蛋白的活力更强，产量更高。附图说明图1为采用本方法发酵的产物枯草芽孢杆菌抗菌蛋白对金黄色葡萄球菌生长造成影响的示意图一；图2为采用本方法发酵的产物枯草芽孢杆菌抗菌蛋白对金黄色葡萄球菌生长造成影响的示意图二。具体实施方式本专利技术一种提高枯草芽孢杆菌抗菌蛋白产量的发酵方法，包括步骤为：先获取菌种，然后将获取的菌种接种到发酵培养基中进行发酵获得枯草芽孢杆菌抗菌蛋白，根据菌体发酵开始后前6～16小时的对数生长期和菌体发酵开始16小时后至发酵结束的稳定期生长状况按照发酵时间进行分段调整：在枯草芽孢杆菌抗菌蛋白发酵过程前调控菌种接种量，发酵过程中调控体系的温度、溶氧量、pH值、摇床转速，通过以上参数的调整可使发酵前期菌种能够快速稳定的生长，发酵中后期菌种能够高效稳定的产抗菌蛋白，降低其它副产物的生成。具体的发酵方法为：S1、购买枯草芽孢杆菌菌种，其编号为BNCC189983，于北纳创联生物技术有限公司(BNCC)生物所保存。S2、将发酵菌种BNCC189983枯草芽孢杆菌接种到营养成分(按照质量百分比计)为葡萄糖1.0％，蛋白胨1.0％，NaCl1.0％，KH2PO40.15％，MgSO4·7H2O0.15％，余量的水，种子培养基中培养12～16小时得种子液，培养温度为37℃，培养基初始pH值为7.0。S3、将产枯草芽孢杆菌BNCC189983抗菌蛋白的菌种种子液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高枯草芽孢杆菌抗菌蛋白产量的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：先获取枯草芽孢杆菌株，再将菌株接种到种子培养基中培养，得到种子液，然后将种子液接种到发酵培养基中发酵，在发酵过程中按对数生长期和稳定期进行分段调控发酵体系的温度、溶氧量、pH值以及摇床转速，最终后处理获得枯草芽孢杆菌抗菌蛋白产物。

【技术特征摘要】
1.一种提高枯草芽孢杆菌抗菌蛋白产量的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：先获取枯草芽孢杆菌株，再将菌株接种到种子培养基中培养，得到种子液，然后将种子液接种到发酵培养基中发酵，在发酵过程中按对数生长期和稳定期进行分段调控发酵体系的温度、溶氧量、pH值以及摇床转速，最终后处理获得枯草芽孢杆菌抗菌蛋白产物。2.根据权利要求1所述的一种提高枯草芽孢杆菌抗菌蛋白产量的发酵方法，其特征在于，控制菌种接种量为2～6％。3.根据权利要求1所述的一种提高枯草芽孢杆菌抗菌蛋白产量的发酵方法，其特征在于，接种到种子培养基中的培养具体步骤为：将枯草芽孢杆菌株接种于斜面，于36～38℃恒温培养箱中培养，然后将斜面培养基上活化后的菌株制备成菌悬液，再接种于种子培养基中，于36～38℃、200～220r/min的摇床上震荡培养12～16小时得种子液。4.根据权利要求3所述的一种提高枯草芽孢杆菌抗菌蛋白产量的发酵方法，其特征在于，按照质量百分比计，所述种子培养基包括葡萄糖1.0％，蛋白胨1.0％，NaCl1.0％，KH2PO40.15％，MgSO4·7H2O0.15％，及余量的水；pH值为7.0。5.根据权利1要求所述的一种提高枯草芽孢杆菌抗菌蛋白产量的发酵方法，其特征在于，所述发酵具体步骤为：将种子液按照体...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚国利，刘志强，张曦文，佐静，
申请(专利权)人：陕西科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61