一种砀山酥梨直接器官发生型再生途径的构建方法技术

本发明专利技术提供了一种砀山酥梨直接器官发生型再生途径的构建方法，步骤如下：(1)外植体的获取：来源两种，一种为叶龄在20～50d的砀山酥梨组培苗叶片；另一种，先利用梨种无菌播种，再采用无菌实生苗的叶片作为外植体；(2)外植体的预处理：在梨叶片中脉横切2～4个刀口，再置于预培养培养基暗培养；(3)不定芽的诱导及增殖：将叶片接种至诱导培养基上暗培养，再转至光周期培养室诱导不定芽；剪下不定芽，接种至增殖培养基。本发明专利技术首次建立了遗传稳定的砀山酥梨叶片直接再生体系，叶片再生率达78.6％，平均每叶产生不定芽数3.8，褐化率0；此方法不仅可由梨叶片器官直接产生大量不定芽，还具有遗传稳定、周期短、成本低等优势。

Construction of a direct organogenetic regeneration pathway for Dangshan crisp pear

The invention provides a method for constructing direct organogenetic regeneration pathway of Dangshan crisp pear. The steps are as follows: (1) acquisition of explants: two kinds of sources, one is the leaves of Dangshan crisp pear tissue-cultured seedlings with leaf age of 20-50 days; the other one is to use the leaves of pear seedlings as explants after aseptic seeding; (2) pretreatment of explants: cutting 2-4 veins in the leaves of Dangshan crisp pear. (3) Adventitious bud induction and proliferation: leaves were inoculated on the induction medium, then transferred to the photoperiod chamber to induce adventitious buds; adventitious buds were cut off and inoculated into the proliferation medium. For the first time, a genetically stable direct regeneration system of Dangshan crisp pear leaves was established, with a leaf regeneration rate of 78.6%, an average number of adventitious buds per leaf of 3.8, and a browning rate of 0. This method can not only directly produce a large number of adventitious buds from pear leaf organs, but also has the advantages of genetic stability, short cycle and low cost.

【技术实现步骤摘要】
一种砀山酥梨直接器官发生型再生途径的构建方法
本专利技术涉及植物细胞工程
，尤其涉及一种砀山酥梨直接器官发生型再生途径的构建方法。
技术介绍
梨是世界性果树树种，属蔷薇科，在五大洲的85个国家均有梨的栽培和分布。梨栽培历史悠久，至少有3000多年的历史，中国早在先秦时代，《诗经·秦风晨风篇》就有记载：“山有苞棣，隰有树檖”。目前梨属植物中被广泛认可的有22种，其中，中国起源的就占13种，因此，中国乃世界上梨品种资源最为丰富的国家。我国梨的主要栽培种包括：白梨、砂梨、秋子梨、新疆梨，其中白梨和砂梨的栽培面积最为广泛。砀山酥梨(Pyrusbretschneidericv.DangshanSu)属于白梨系品种，在我国栽培面积达23.3万hm2，为我国栽培面积最大的梨品种，也是世界第一大商业化栽培品种。砀山酥梨的年产量约4百万吨，具有产量高、耐贮藏等优良性状。与其他栽培品种相比，砀山酥梨具有相对低的杂合率。梨果新鲜味美、果肉酥脆多汁，酸甜可口，风味芳香而且具有较高的营养价值。目前，随着消费者生活水平的提高以及梨品种的丰富，砀山酥梨石细胞含量较高、石细胞团面积大的固有缺陷日益凸显，严重影响了其市场份额。虽然在生产上采取一些调控栽培措施可以在一定程度上改善砀山酥梨果实品质，但是该方法并不能从根本上解决砀山酥梨品质问题，并且各地配套栽培措施水平良莠不齐，不能同步、整体的提升其品质。此外，梨是典型的自交不亲和性物种，遗传背景复杂，且具有杂合性，这使得群体遗传研究难度大，加之梨童期长等原因，导致传统的梨遗传育种改良周期长、效率低。因此，基于植物组织培养、离体组织再生为主体的遗传转化技术在梨上的应用，可以极大推动梨的种质创新和新品种的选育过程。利用基因工程对砀山酥梨品质进行分子改良是其产业发展中的重要任务。与其他物种相比，梨遗传转化起步较晚。1988年，Viseur等率先开始了梨属植物上的转基因工作，他用梨试管苗叶片作外植体，用带致瘤质粒的农杆菌(pTiT37)感染转化，虽然成功诱导出了瘤组织并分化出了不定芽，但最终并未能获得转基因植株。1996年，FabienneMourgues等通过农杆菌EHA101介导法将含有nptII和gus基因的双元载体pFAJ3000转入西洋梨康佛伦斯中，这是第一次梨转化成功的报道。此后，各个国家的科学者对梨的遗传转化都做了进一步的研究，但同国外的研究相比，中国关于该方面的研究比国外晚了近10年，而且在现有的报道中，梨遗传转化主要集中在西洋梨品种上，东方梨鲜有报道，特别是属于东方梨的白梨系品种砀山酥梨。建立遗传稳定、周期短的再生体系是进行植物遗传转化的前提。对于植物组织培养过程中的器官发生途径，可以分为间接器官发生与直接器官发生两种。其中，间接器官发生途径需经过愈伤组织阶段，该阶段耗时长且容易发生体细胞无性系变异，这种自然的遗传变异不定向、不可控，会导致遗传转化的结果可信度下降，同时也可能使得外源基因丢失、沉默，或者使得再生植株产生其他不利的变异性状，因此，此种器官发生途径不稳定，不适用于以性状定向改良为主旨的基因工程育种；而直接器官发生途径，可以不经过愈伤组织阶段直接分化出器官；相比间接器官发生途径而言，直接器官发生途径的周期短、变异率低、遗传稳定，更适合于遗传转化。目前为止，梨叶片再生途径多为间接器官发生途径，因此，建立一种砀山酥梨遗传稳定的再生体系迫在眉睫。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种遗传稳定的砀山酥梨直接器官发生型再生途径的构建方法，以建立砀山酥梨高效稳定的再生体系。本专利技术采用以下技术方案解决上述技术问题：一种砀山酥梨直接器官发生型再生途径的构建方法，包括如下具体步骤：(1)外植体的获取：外植体的获取方式有以下两种，任选其一；方式一：选择叶龄在20～50d的常规砀山酥梨组培苗的无菌叶片作为外植体；方式二：选择梨种子进行层积处理，层积处理后，先利用0.8～1.2％氯化汞消毒10～15min，再利用无菌水清洗3～5次，最后，将其接种于不含激素的改良MS1培养基上进行无菌播种；种子萌发后，取无菌实生苗展开的梨无菌叶片作为外植体；其中，改良MS1培养基为传统MS培养基的改良培养基，改良MS1培养基中：KNO3使用浓度为940～960mg/L，NH4NO3使用浓度为815～835mg/L，其余成分含量不变，另附加5～7g/L琼脂，pH6.8～7.0；(2)外植体的预处理：获得无菌叶片后，在梨叶片中脉横切2～4个刀口，再将其以叶片背面朝下的方式放置在预培养培养基上进行暗培养1.5～2.5天，以完成外植体的预处理；其中，预培养培养基为：改良MS1培养基+10～30g/L山梨醇+6～7g/L琼脂+0.5～1.0ml/LAgNO3；所述改良MS1培养基同步骤(1)中改良MS1培养基；(3)不定芽的诱导及增殖培养：将预处理结束的叶片以背面朝下的方式继续接种至诱导培养基上进行暗培养，暗培养2.5～3.0周后转移至“16h光照、8h黑暗”的光周期培养室中，诱导梨叶片直接产生不定芽；待不定芽生长2～3cm时，剪下不定芽，并将其进一步接种至增殖培养基进行扩繁；其中，不定芽诱导培养基为：NN69培养基+2.0～3.0mg/L6-BA+0.2～0.5mg/LIBA+28～32g/L山梨醇+6～7g/L琼脂+0.5～1.0ml/LAgNO3，培养基pH5.8～6.0；增殖培养基为：改良MS2培养基+1.5～3.0mg/L6-BA+0.2～0.5mg/LIBA+28～32g/L蔗糖+6～7g/L琼脂，培养基pH5.8～6.0；所述改良MS2培养基为传统MS培养基的改良培养基，改良MS2培养基中：CaCl2使用浓度为41～42mg/L，KH2PO4使用浓度为21～21.5mg/L，其余成分含量不变。作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(1)中，层积处理指：将梨种子埋在湿沙中，置于1～10℃温度中，经1～3个月的低温处理，有效解除休眠。作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(1)和步骤(2)中，改良MS1培养基为传统MS培养基的改良培养基，改良MS1培养基中：KNO3使用浓度为950mg/L，NH4NO3使用浓度为825mg/L，其余成分含量不变，另附加6g/L琼脂，pH7.0。作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(3)中，不定芽诱导培养基具体为：NN69培养基+2.5mg/L6-BA+0.35mg/LIBA+30g/L山梨醇+6.5g/L琼脂+0.75ml/LAgNO3，培养基pH5.9。作为本专利技术的优选方式之一，所述NN69培养基配方为：每升培养基中含720mg/LNH4NO3，950mg/LKNO3，185mg/LMgSO4·7H2O，166mg/LCaCl2·2H2O，68mg/LKH2PO4，37.3mg/LNa2EDTA，27.8mg/LFeSO4·7H2O，3.0mg/LH3BO3，25mg/LMnSO4·4H2O，10mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，0.08mg/LCuSO4·5H2O，100mg/L肌醇，2.0mg/L甘氨酸，5.0mg/L烟酸，0.5mg/L盐酸吡哆醇B6，0.5mg/L盐酸硫胺素B1。作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种砀山酥梨直接器官发生型再生途径的构建方法，其特征在于，包括如下具体步骤：(1)外植体的获取：外植体的获取方式有以下两种，任选其一；方式一：选择叶龄在20～50d的常规砀山酥梨组培苗的无菌叶片作为外植体；方式二：选择梨种子进行层积处理，层积处理后，先利用0.8～1.2％氯化汞消毒10～15min，再利用无菌水清洗3～5次，最后，将其接种于不含激素的改良MS1培养基上进行无菌播种；种子萌发后，取无菌实生苗展开的梨无菌叶片作为外植体；其中，改良MS1培养基为传统MS培养基的改良培养基，改良MS1培养基中：KNO3使用浓度为940～960mg/L，NH4NO3使用浓度为815～835mg/L，其余成分含量不变，另附加5～7g/L琼脂，pH 6.8～7.0；(2)外植体的预处理：获得无菌叶片后，在梨叶片中脉横切2～4个刀口，再将其以叶片背面朝下的方式放置在预培养培养基上进行暗培养1.5～2.5天，以完成外植体的预处理；其中，预培养培养基为：改良MS1培养基+10～30g/L山梨醇+6～7g/L琼脂+0.5～1.0ml/L AgNO3；所述改良MS1培养基同步骤(1)中改良MS1培养基；(3)不定芽的诱导及增殖培养：将预处理结束的叶片以背面朝下的方式继续接种至诱导培养基上进行暗培养，暗培养2.5～3.0周后转移至“16h光照、8h黑暗”的光周期培养室中，诱导梨叶片直接产生不定芽；待不定芽生长2～3cm时，剪下不定芽，并将其进一步接种至增殖培养基进行扩繁；其中，不定芽诱导培养基为：NN69培养基+2.0～3.0mg/L 6‑BA+0.2～0.5mg/L IBA+28～32g/L山梨醇+6～7g/L琼脂+0.5～1.0ml/L AgNO3，培养基pH5.8～6.0；增殖培养基为：改良MS2培养基+1.5～3.0mg/L 6‑BA+0.2～0.5mg/L IBA+28～32g/L蔗糖+6～7g/L琼脂，培养基pH 5.8～6.0；所述改良MS2培养基为传统MS培养基的改良培养基，改良MS2培养基中：CaCl2使用浓度为41～42mg/L，KH2PO4使用浓度为21～21.5mg/L，其余成分含量不变。...

【技术特征摘要】
1.一种砀山酥梨直接器官发生型再生途径的构建方法，其特征在于，包括如下具体步骤：(1)外植体的获取：外植体的获取方式有以下两种，任选其一；方式一：选择叶龄在20～50d的常规砀山酥梨组培苗的无菌叶片作为外植体；方式二：选择梨种子进行层积处理，层积处理后，先利用0.8～1.2％氯化汞消毒10～15min，再利用无菌水清洗3～5次，最后，将其接种于不含激素的改良MS1培养基上进行无菌播种；种子萌发后，取无菌实生苗展开的梨无菌叶片作为外植体；其中，改良MS1培养基为传统MS培养基的改良培养基，改良MS1培养基中：KNO3使用浓度为940～960mg/L，NH4NO3使用浓度为815～835mg/L，其余成分含量不变，另附加5～7g/L琼脂，pH6.8～7.0；(2)外植体的预处理：获得无菌叶片后，在梨叶片中脉横切2～4个刀口，再将其以叶片背面朝下的方式放置在预培养培养基上进行暗培养1.5～2.5天，以完成外植体的预处理；其中，预培养培养基为：改良MS1培养基+10～30g/L山梨醇+6～7g/L琼脂+0.5～1.0ml/LAgNO3；所述改良MS1培养基同步骤(1)中改良MS1培养基；(3)不定芽的诱导及增殖培养：将预处理结束的叶片以背面朝下的方式继续接种至诱导培养基上进行暗培养，暗培养2.5～3.0周后转移至“16h光照、8h黑暗”的光周期培养室中，诱导梨叶片直接产生不定芽；待不定芽生长2～3cm时，剪下不定芽，并将其进一步接种至增殖培养基进行扩繁；其中，不定芽诱导培养基为：NN69培养基+2.0～3.0mg/L6-BA+0.2～0.5mg/LIBA+28～32g/L山梨醇+6～7g/L琼脂+0.5～1.0ml/LAgNO3，培养基pH5.8～6.0；增殖培养基为：改良MS2培养基+1.5～3.0mg/L6-BA+0.2～0.5mg/LIBA+28～32g/L蔗糖+6～7g/L琼脂，培养基pH5.8～6.0；所述改良MS2培养基为传统MS培养基的改良培养基，改良MS2培养基中：CaCl2使用浓度为41～42...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡永萍，程曦，李国辉，赵宇，孙燕铭，金青，张金云，林毅，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34