一种花生突变体的快速筛选方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种花生突变体的快速筛选方法及应用，属于花生育种领域。本发明专利技术花生突变体的快速筛选方法，是对花生离体诱变获得的再生苗，采用SSR方法进行基因型上的突变性鉴定，淘汰基因型未突变的再生苗，鉴定的基因型突变的再生苗即为花生突变体。本发明专利技术对组培苗的突变性进行鉴定方法简单，能够有效淘汰未突变的再生苗，节省未突变再生苗嫁接移栽及后续突变性鉴定的无效劳动，从而节省人力物力财力。通过SSR方法筛选花生基因型突变体结合子代性状筛选方法，能够缩短育种时间2‑3年。对于一些表型无明显变异，但品质性状发生变异的突变体，能通过SSR方法也能鉴定出。

A Rapid Screening Method for Peanut Mutants and Its Application

The invention discloses a rapid screening method for peanut mutants and its application, which belongs to the field of peanut breeding. The rapid screening method for peanut mutants of the invention is to identify the mutagenicity of the regenerated seedlings obtained by in vitro mutagenesis of peanut by SSR method, eliminate the regenerated seedlings without mutagenesis of the genotype, and identify the regenerated seedlings with mutagenesis of the genotype is the peanut mutant. The method for identifying the mutation of tissue culture seedlings is simple, and can effectively eliminate the regenerated seedlings without mutation, save the invalid labor of grafting and transplanting of the regenerated seedlings without mutation and subsequent mutation identification, thereby saving manpower, material and financial resources. SSR screening of peanut genotype mutants combined with progeny traits could shorten the breeding time by 2 to 3 years. For some mutants with no obvious phenotypic variation, but with variation in quality traits, they can also be identified by SSR method.

【技术实现步骤摘要】
一种花生突变体的快速筛选方法及应用
本专利技术属于花生育种领域，具体涉及一种花生突变体的快速筛选方法及应用。
技术介绍
花生是我国重要的油料作物和经济作物之一，培育高产优质专用多抗性新品种是目前花生重要的育种目标。然而，花生栽培种遗传多样性较低，缺乏高抗、高油、耐盐、高产性的优良品种资源，因此依靠杂交育种难以获得突破性进展。诱变技术的应用可促进花生种质资源创新和加速品种改良进程，因为诱变育种可以诱导产生自然界不存在的或极为罕见的新性状、新类型。但常规诱变育种技术，往往突变体嵌合性严重，因为突变是单细胞行为，因此造成很多性状不能稳定遗传，尤其是一些隐性突变往往被掩盖。并且花生种子较大，在物理辐照时往往处理的种子较少，并且常以半致死量为适宜的诱变剂量，也即辐照处理的种子约一半不能正常发芽生长，因此达不到育种的选择群体，因为诱变育种往往需要足够大的群体才能获得有益突变体。诱变与组织培养相结合，可以得到丰富的变异体，提高变异频率，增加选择几率；克服突变体的嵌合性，提高变异性状的稳定性，隐性突变可充分表现。但在诱变结合组织培养的离体诱变中，可获得大量再生苗，包括突变的及未突变的再生苗。再生苗需经过嫁接、驯化炼苗才能移栽田间，程序复杂，需花费大量人力物力财力。并且移栽田间后获得的种子，第二年播种田间(M2代)，生育期间及收获后才能观察到表型明显变异的材料，而品质性状的变异需要各种测试，如含油率、蛋白含量、脂肪酸含量、各种糖分含量等。因此，离体诱变中突变体的常规鉴定，从诱变开始到可进行变异鉴定需要2～3年时间，不但时间长，并且各个阶段工作量大，需耗费大量人力物力财力。目前，SSR方法在花生农艺性状标记上(周金超、杨鑫雷、崔顺立等，花生SSR标记与农艺性状的相关性，作物学报，2014，40(7)：1197-1204)，花生SSR指纹图谱构建及遗传多样性分析(胡晓辉、毛瑞喜、苗华荣等，山东省46个花生品种SSR指纹图谱构建及遗传多样性分析，核农学报，2016，30(10)：1925—1933)等方面有利用。苗华荣等(苗华荣、胡晓辉、崔凤高等，花生辐照后M2代突变材料的SSR分析，核农学报，2012,24(4)：680-683)对花生种子辐照后，表型明显变异的M2代突变材料进行SSR分析，结果表明突变体的DNA分子有重复或缺失等结构性变异。但利用SSR方法进行突变体筛选(鉴定)，尚未见报道。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题，本专利技术针对离体诱变获得的再生苗，即试管苗，采用SSR方法进行突变性鉴定，淘汰基因型未突变的再生苗，突变的再生苗经嫁接炼苗移栽田间，采用如此方法，花生育种可节省大量人力物力财力。为了达到上述目的，本专利技术的技术方案为：一种花生突变体的快速筛选方法，步骤为：(1)提取诱变亲本花生品种和诱变后再生苗叶片的全基因组DNA，进行SSR的PCR扩增；(2)对比诱变亲本花生和诱变后再生苗的SSR扩增结果，选择扩增结果呈现多态性的再生苗即为花生突变体，淘汰基因型未突变的再生苗。在上述方案的基础上，所述扩增结果呈现多态性是指扩增片段减少、扩增片段增加或扩增片段长度差异。在上述方案的基础上，所述SSR的PCR扩增结果的检测方法为：将扩增产物在8％非变性PAGE凝胶上电泳，电泳缓冲液位1×TBE，每个点样孔加1.5μL样品，200伏恒电压下电泳约90分钟，电泳结束后，进行银染检测。在上述方案的基础上，所述SSR的PCR扩增体系为：模板1.5μL，Taq酶0.2μL，10×Taqbuffer7.5μL，正反向引物各0.6μL，ddH2O4.6μL；所述SSR的PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性13min，55℃退火1min，72℃延长90s，34个循环；72℃延长10min。上述花生突变体的快速筛选方法在花生育种上的应用。一种花生快速育种方法，步骤如下：(1)选择颗粒饱满的花生种子进行诱变育种；所述的诱变育种可以是快中子辐照或高能混合粒子场辐照处理，其中，辐照剂量为9.7Gy～18.0Gy或67Gy～105Gy；(2)经辐照处理的花生种子去子叶，取种胚，对种胚进行表面消毒处理；(3)将消毒后的种胚置于无菌水中浸泡10～14h后，分离浸泡处理后种胚的胚小叶；(4)将胚小叶作为外植体置于添加10mg/L2,4-D的体胚诱导培养基上培养4周，诱导体胚形成；(5)将形成体胚的胚小叶外植体转移到添加4mg/LBAP的体胚萌发和再生培养基上进行培养，诱导体胚萌发成再生苗，每4周继代培养一次；(6)采用SSR方法筛选基因型发生突变的再生苗为花生突变体，淘汰基因型未突变的再生苗；(7)将花生突变体无菌嫁接到砧木上，经炼苗后种植于大田，收获种子；(8)将收获的种子连续自交至M5代，通过生育期间及收获后性状观察和/或种子营养成分测定，选择各种变异的花生突变体。在上述方案的基础上，所述的表面消毒处理为：将种胚置于75％的酒精浸泡20s，再用0.1％的升汞浸泡10min，最后用无菌水漂洗5次。在上述方案的基础上，所述体胚诱导培养基为MS+10mg/L2,4-D+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH调至5.8；所述体胚萌发和再生培养基为MS+4mg/LBAP+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH调至5.8。在上述方案的基础上，所述体胚诱导培养、体胚萌发和再生培养的培养条件为：温度为25～26℃、光照强度为2000～3000Lx、每日光照为12～15h。本专利技术技术方案的优点本专利技术对组培苗的突变性进行鉴定方法简单，能够有效淘汰未突变的再生苗，节省未突变再生苗嫁接移栽及后续突变性鉴定的无效劳动，从而节省人力物力财力。通过SSR方法筛选花生基因型突变体结合子代性状筛选方法，能够缩短育种时间2-3年。对于一些表型无明显变异，但品质性状发生变异的突变体，能通过SSR方法也能鉴定出。附图说明图1辐照处理后种子胚小叶外植体形成的体胚和愈伤组织；图2辐照处理种子胚小叶外植体形成的体胚萌发长成的小苗；图3SSR引物WH070的扩增产物电泳图(CK：诱变亲本鲁花11号；1-19：再生苗)；图4SSR引物PM348的扩增产物电泳图(CK：诱变亲本鲁花11号；1-15：再生苗)；图5SSR引物WH015的扩增产物电泳图(CK：诱变亲本鲁花11号；1-12：再生苗)；图6SSR表现多态性、株高和分枝数明显变异的植株及诱变亲本鲁花11号植株；图7SSR表现多态性、形状和大小明显变异的荚果及诱变亲本鲁花11号的荚果；图8SSR表现多态性、种皮颜色突变为紫色的突变体种子和诱变亲本鲁花11号的种子(粉红色)；图9SSR表现多态性、内种皮颜色突变为桔黄色的突变体的种子和诱变亲本鲁花11号的种子(内种皮白色红色)。具体实施方式在本专利技术中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本专利技术。以下实施例只是为了举例说明本专利技术，而非以任何方式限制本专利技术的范围。实施例1鲁花11号突变体快速筛选及育种方法1、辐照处理选择颗粒饱满的鲁花11号种子(由青岛农业大学种植保存)，在中国原子能科学研究院进行快中子辐照处理，辐照剂量为9.7Gy，以不进行辐照为对照。2、制备培养基(1)制备体胚诱导培养基：选取MS本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种花生突变体的快速筛选方法，其特征在于：对花生离体诱变获得的再生苗，采用SSR方法进行基因型上的突变性鉴定，淘汰基因型未突变的再生苗，鉴定的基因型突变的再生苗即为花生突变体。

【技术特征摘要】
1.一种花生突变体的快速筛选方法，其特征在于：对花生离体诱变获得的再生苗，采用SSR方法进行基因型上的突变性鉴定，淘汰基因型未突变的再生苗，鉴定的基因型突变的再生苗即为花生突变体。2.根据权利要求1所述花生突变体的快速筛选方法，其特征在于：步骤为：(1)提取诱变亲本花生品种和诱变后再生苗叶片的全基因组DNA，进行SSR的PCR扩增；(2)对比诱变亲本花生和诱变后再生苗的SSR扩增结果，选择扩增结果呈现多态性的再生苗即为花生突变体，淘汰基因型未突变的再生苗。3.根据权利要求2所述花生突变体的快速筛选方法，其特征在于：所述扩增结果呈现多态性是指扩增片段减少、扩增片段增加或扩增片段长度差异。4.根据权利要求1～3任一项所述花生突变体的快速筛选方法，其特征在于：所述SSR的PCR扩增结果的检测方法为：将扩增产物在8％非变性PAGE凝胶上电泳，电泳缓冲液位1×TBE，每个点样孔加1.5μL样品，200伏恒电压下电泳约90分钟，电泳结束后，进行银染检测。5.根据权利要求4所述花生突变体的快速筛选方法，其特征在于：所述SSR的PCR扩增体系为：模板1.5μL，Taq酶0.2μL，10×Taqbuffer7.5μL，正反向引物各0.6μL，ddH2O4.6μL；所述SSR的PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性13min，55℃退火1min，72℃延长90s，34个循环；72℃延长10min。6.权利要求1～5任一项所述花生突变体的快速筛选方法在花生育种上的应用。7.一种花生快速育种...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晶珊，禹山林，乔利仙，隋炯明，杨庆利，李冠，赵明霞，姜德锋，郭宝太，朱虹，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37