用于对用两亲强碱性部分改性的聚糖进行分析的带电表面反相色谱材料方法技术

本发明专利技术提供了使用包含色谱表面的高纯度色谱材料以及能够向待分析的样品提供两亲强碱性标记部分的标记试剂来对聚糖进行色谱分析的新型方法，其中所述色谱表面包含疏水表面基团和一种或多种可电离改性剂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于对用两亲强碱性部分改性的聚糖进行分析的带电表面反相色谱材料方法
技术介绍
聚糖在整个生物系统中以游离状态以及作为糖蛋白、糖脂和蛋白聚糖的一部分以缀合形式存在。聚糖在各种生物和生理过程中发挥作用。此外，聚糖的结构纷繁复杂。因此，对聚糖谱进行全面分析一直存在困难。之前已经利用了常规HPLC色谱来分析聚糖谱。这些方法包括反相色谱、离子交换色谱和HILIC分离。传统上，已经通过HILIC或者通过使用石墨固定相(诸如，多孔石墨化碳)和用甲酸酸化的流动相的反相色谱分离了释放的聚糖。(West,C.；Elfakir,C.；Lafosse,M.,Porousgraphiticcarbon:aversatilestationaryphaseforliquidchromatography.JChromatogrA2010,1217(19),3201-16；Ruhaak,L.R.；Zauner,G.；Huhn,C.；Bruggink,C.；Deelder,A.M.；Wuhrer,M.,Glycanlabelingstrategiesandtheiruseinidentificationandquantification.AnalBioanalChem2010,397(8),3457-81)。然而，由于聚糖具有亲水性和极性，这些方法不能提供足够的灵敏度来全面分析聚糖。另外，为了增加方法灵敏度而用各种部分标记的许多聚糖被过强地保留并且不能被充分拆分。类似地，利用与C18键合的反相固定相，分离过程往往会产生有问题的共洗脱，因为净电荷方面有差别的聚糖结构之间的选择性较差。从糖蛋白诸如人免疫球蛋白G(hIgG)释放的N-聚糖与糖蛋白本身完全不同。具体地讲，释放的N-聚糖表现出不同于肽的电荷特性，因为它们通常仅含中性或酸性亲水残基。释放的N-聚糖中的酸性残基及其羧酸或磷酸基团对聚糖物质的特性和净电荷状态具有显著影响。含更多酸性残基的聚糖将具有更负的净电荷。类似地，这些酸性物质通常与生物药物的功效相关，正如依泊亭和溶酶体疾病酶替代疗法的情况。(Lauber,M.A.；Koza,S.M.；McCall,S.A.；Alden,B.A.；Iraneta,P.C.；Fountain,K.J.,High-ResolutionPeptideMappingSeparationswithMS-FriendlyMobilePhasesandCharge-Surface-ModifiedC18.AnalChem2013,85(14),6936-44；Bennett,C.L.；Spiegel,D.M.；Macdougall,I.C.；Norris,L.；Qureshi,Z.P.；Sartor,O.；Lai,S.Y.；Tallman,M.S.；Raisch,D.W.；Smith,S.W.；Silver,S.；Murday,A.S.；Armitage,J.O.；Goldsmith,D.,Areviewofsafety,efficacy,andutilizationoferythropoietin,darbepoetin,andpeginesatideforpatientswithcancerorchronickidneydisease:areportfromtheSouthernNetworkonAdverseReactions(SONAR).SeminThrombHemost2012,38(8),783-96)。新型柱技术(诸如，美国专利公布No.2013/0319086中描述的技术)提供了新型多元色谱介质和聚糖分析方法，这在不同生物大分子之间提供了高分辨率，并且基于大小、组成、结构(例如，异构、键合)和/或电荷提供了独特的选择性。此外，这些柱允许通过标准方法(例如，质谱、荧光检测)检测从介质中洗脱的大分子，而无需或很少需要净化或纯化事后分析和预检测(例如，荧光标记)，这将极大地简化和方便大分子分析。然而，这种技术仍然不能提供足够的灵敏度和选择性来完全分离聚糖，特别是N-聚糖。此外，对于O-聚糖也是如此。因此，仍然需要在聚糖分析中提供优异选择性的替代方法。对N-聚糖进行荧光标记有利于检测聚糖，因为它提高了检测的灵敏度和选择性以及聚糖的色谱行为。聚糖分析对于药物制造商很重要，因为必须监测蛋白质的糖基化分布以确保治疗产品的一致性。在用具有荧光部分的试剂进行衍生化后，可以估计聚糖的身份。然后需要用质谱法(“MS”)来鉴定特定化合物。利用MS的分析在聚糖和氨基酸分析以及蛋白质组学方面已达到高度发展。现有技术利用反应快速并且提供良好MS/荧光信号的标记分子。然而，期望的是MS和荧光检测的组合，因为荧光检测在确定以不同数量存在的相对量时是非常有用的工具。另一方面，MS用于确定分子构成。用于现有技术的聚糖检测的选择标签在相对高的疏水性与高pKa可电离残基配对时往往是独特的，使得它们成为所谓的“两亲强碱性”部分。因此，需要对于用两亲强碱性部分标记的聚糖产生最佳选择性和分辨率的色谱材料和相应的分离方法。
技术实现思路
本专利技术提供了使用包含色谱表面的高纯度色谱材料(HPCM)以及能够向待分析的样品提供两亲强碱性标记部分的标记试剂来对标记的聚糖进行色谱分析的新型方法，其中色谱表面包含疏水表面基团和一种或多种可电离改性剂。在一个方面，本专利技术提供了一种从样品中选择性分离聚糖的方法，该方法包括以下步骤：a)使包含聚糖的样品与标记试剂反应以产生标记的聚糖样品b)将标记的聚糖样品上样到色谱分离装置上，该色谱分离装置包括包含色谱表面的高纯度色谱材料，其中色谱表面包含疏水表面基团和一种或多种可电离改性剂，条件是当可电离改性剂不含两性离子时，可电离改性剂不含季铵离子部分，使得聚糖选择性地吸附到高纯度色谱材料上；以及c)从高纯度色谱材料中洗脱吸附的标记聚糖，从而从样品中选择性分离标记的聚糖。在另一个方面，本专利技术提供了一种从样品中分离多种聚糖的方法，该方法包括以下步骤：a)使包含多种聚糖的样品与标记试剂反应以产生标记的聚糖样品b)将含多种聚糖的标记聚糖样品上样到色谱分离装置上，该色谱分离装置包括包含色谱表面的高纯度色谱材料，其中色谱表面包含疏水表面基团和一种或多种可电离改性剂，条件是当可电离改性剂不含两性离子时，可电离改性剂不含季铵离子部分，使得聚糖吸附到高纯度色谱材料上；以及c)从高纯度色谱材料中洗脱吸附的标记聚糖，从而分离标记的聚糖。在再一个方面，本专利技术提供了一种纯化样品中所含的聚糖的方法，该方法包括：a)使包含聚糖的样品与标记试剂反应以产生标记的聚糖样品b)将标记的聚糖样品上样到色谱分离装置上，该色谱分离装置包括包含色谱表面的高纯度色谱材料，其中色谱表面包含疏水表面基团和一种或多种可电离改性剂，条件是当可电离改性剂不含两性离子时，可电离改性剂不含季铵离子部分，使得聚糖吸附到高纯度色谱材料上；以及c)从高纯度色谱材料中洗脱吸附的聚糖，从而纯化聚糖。在又一个方面，本专利技术提供了一种用于检测样品中的聚糖的方法，该方法包括以下步骤：a)使包含聚糖的样品与标记试剂反应以产生标记的聚糖样品a)将标记的聚糖样品上样到色谱分离装置上，该色谱分离装置包括包含色谱表面的高纯度色谱材料，其中色谱表面包含疏水表面本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从样品中选择性分离聚糖的方法，所述方法包括以下步骤：a)使包含聚糖的样品与标记试剂反应以产生标记的聚糖样品b)将所述标记的聚糖样品上样到色谱分离装置上，所述色谱分离装置包括包含色谱表面的高纯度色谱材料，其中所述色谱表面包含疏水表面基团和一种或多种可电离改性剂，条件是当所述可电离改性剂不含两性离子时，所述可电离改性剂不含季铵离子部分，使得所述聚糖选择性地吸附到所述高纯度色谱材料上；以及c)从所述高纯度色谱材料中洗脱所述吸附的标记聚糖，从而从所述样品中选择性分离所述标记的聚糖。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.04.24 US 62/3267831.一种从样品中选择性分离聚糖的方法，所述方法包括以下步骤：a)使包含聚糖的样品与标记试剂反应以产生标记的聚糖样品b)将所述标记的聚糖样品上样到色谱分离装置上，所述色谱分离装置包括包含色谱表面的高纯度色谱材料，其中所述色谱表面包含疏水表面基团和一种或多种可电离改性剂，条件是当所述可电离改性剂不含两性离子时，所述可电离改性剂不含季铵离子部分，使得所述聚糖选择性地吸附到所述高纯度色谱材料上；以及c)从所述高纯度色谱材料中洗脱所述吸附的标记聚糖，从而从所述样品中选择性分离所述标记的聚糖。2.一种从样品中分离多种聚糖的方法，所述方法包括以下步骤：a)使包含多种聚糖的样品与标记试剂反应以产生标记的聚糖样品b)将含多种聚糖的所述标记聚糖样品上样到色谱分离装置上，所述色谱分离装置包括包含色谱表面的高纯度色谱材料，其中所述色谱表面包含疏水表面基团和一种或多种可电离改性剂，条件是当所述可电离改性剂不含两性离子时，所述可电离改性剂不含季铵离子部分，使得所述聚糖吸附到所述高纯度色谱材料上；以及c)从所述高纯度色谱材料中洗脱所述吸附的标记聚糖，从而分离所述标记的聚糖。3.一种纯化样品中所含的聚糖的方法，所述方法包括：a)使包含聚糖的样品与标记试剂反应以产生标记的聚糖样品b)将所述标记的聚糖样品上样到色谱分离装置上，所述色谱分离装置包括包含色谱表面的高纯度色谱材料，其中所述色谱表面包含疏水表面基团和一种或多种可电离改性剂，条件是当所述可电离改性剂不含两性离子时，所述可电离改性剂不含季铵离子部分，使得所述聚糖吸附到所述高纯度色谱材料上；以及c)从所述高纯度色谱材料中洗脱所述吸附的聚糖，从而纯化所述聚糖。4.一种用于检测样品中的聚糖的方法，所述方法包括以下步骤：a)使包含聚糖的样品与标记试剂反应以产生标记的聚糖样品a)将所述标记的聚糖样品上样到色谱分离装置上，所述色谱分离装置包括包含色谱表面的高纯度色谱材料，其中所述色谱表面包含疏水表面基团和一种或多种可电离改性剂，条件是当所述可电离改性剂不含两性离子时，所述可电离改性剂不含季铵离子部分，使得所述聚糖吸附到所述高纯度色谱材料上；以及b)从所述高纯度色谱材料中洗脱所述吸附的聚糖；以及c)检测所述聚糖。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述聚糖为N-聚糖或O-聚糖。6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述聚糖为hIgG聚糖、胎球蛋白聚糖、FA2BG2S2、FA2G2S1或FA2G2。7.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述聚糖标记试剂为MS-活性的快速荧光标记化合物；普鲁卡因胺试剂或普鲁卡因试剂。8.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述聚糖标记试剂提供LogP值介于0和5之间的两亲强碱性部分。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述LogP值介于1和5之间。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述LogP值介于1和3之间。11.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述聚糖标记试剂提供pKa值大于6的两亲强碱性部分。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述pKa值大于7。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述pKa值大于8。14.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述聚糖标记试剂为具有下式的试剂：15.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述高纯度色谱材料还包含色谱芯材料。16.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述可电离改性剂含有羧酸基、磺酸基、芳基磺酸基、磷酸基、硼酸基、氨基、亚氨基、酰氨基、吡啶基、咪唑基、脲基、亚硫酰-脲基、脒基、胍基或氨基硅烷基。17.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述色谱表面上的所述可电离改性剂通过使所述色谱表面与选自具有以下各式的可电离改性试剂反应来提供：式(I)、式(II)、式(III)，或它们的组合其中m为1-8的整数；V为0或1；当V为0时，m'为0；当V为1时，m'为1-8的整数；Z表示化学反应性基团，包括(但不限于)-OH、-OR6、胺、烷基胺、二烷基胺、异氰酸酯、酰氯、三氟甲磺酸酯、异氰酸酯、硫氰酸酯、碳酸咪唑、NHS-酯、羧酸、酯、环氧化物、炔烃、烯烃、叠氮化物、-Br、-Cl或-I；Y为嵌入式极性官能团；每次出现的R1独立地表示硅上的化学反应性基团，包括(但不限于)-H、-OH、-OR6、二烷基胺、三氟甲磺酸酯、Br、Cl、I、乙烯基、烯烃或-(CH2)m-Q；每次出现的Q为-OH、-OR6、胺、烷基胺、二烷基胺、异氰酸酯、酰氯、三氟甲磺酸酯、异氰酸酯、硫氰酸酯、碳酸咪唑、NHS-酯、羧酸、酯、环氧化物、炔烃、烯烃、叠氮化物、-Br、-Cl或-I；m”为1-8的整数p为1-3的整数；每次出现的R1’独立地表示F、C1-C18烷基、C2-C18烯基、C2-C18炔基、C3-C18环烷基、C1-C18杂环烷基、C5-C18芳基、C5-C18芳氧基或C1-C18杂芳基、氟代烷基或氟代芳基；每次出现的R2、R2’、R3和R3’独立地表示氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、C2-C1...

【专利技术属性】
技术研发人员：MA劳伯，SA麦考尔，B奥肯德吉，PC伊拉内塔，
申请(专利权)人：沃特世科技公司，
类型：发明
国别省市：美国,US