一种单分子蛋白的检测方法技术

本发明专利技术属于蛋白检测领域，公开了一种单分子蛋白的检测方法，待测蛋白与靶蛋白抗体混合生成待测蛋白与靶蛋白抗体复合物，与经标记物标记的检测抗体混合解离收集待测蛋白和检测抗体的复合物；所述标记物为荧光素标记物或酶标记物；将所述待测蛋白和检测抗体的复合物直接分散于微流控芯片或先将所述待测蛋白和检测抗体的复合物与酶标记物对应的底物混合反应然后将反应液分散于微流控芯片中；利用激光共聚焦检测系统进行荧光信号扫描，单分子计数。本发明专利技术所述检测方法可以快速对单分子蛋白进行定量检测，检测灵敏度高，适用于对表达丰度过低的蛋白。本发明专利技术所述检测方法操作方便，检测结果准确、CV值偏差小；而且通量高，可一次性检测多个样本。

【技术实现步骤摘要】
一种单分子蛋白的检测方法
本专利技术属于蛋白检测领域，具体涉及一种单分子蛋白的检测方法。
技术介绍
蛋白，作为机体最重要的组成成分，诠释着生命个体每一点的生长，发育和变化。从上世纪40年代开始，随着免疫组化等经典蛋白检测技术的发展，蛋白作为生物标志物的价值逐渐被人们所重视。尽管免疫组化，ELISA，Luminex等蛋白检测技术已经实现了数以千计的蛋白生物标志物检测，但蛋白生物标志物的开发速度仍显缓慢：年均仅有1-2个新的生物标志物进入实际的临床应用。据统计，在400,000多种已知的人类蛋白中，约有300,000种因为表达丰度过低而无法实现传统方法的检测。在现有技术可以检测的约100,000种蛋白中，大多数又无法在健康个体的样本中检测到，而仅仅出现在特定的疾病时期。大量蛋白生物标志物的重要功能，如同海平面下的冰山，无法被现有技术准确界定。不论临床还是基础研究，蛋白生物标志物的应用都拥有可观的发展前景，但现有技术的瓶颈极大限制了蛋白生物标志物的发展。默克公司推出了单分子检测技术驱动的免疫检测平台，采用激光检测对每个单分子二抗上标记的荧光信号进行计数。其中的单分子检测技术(SingleM本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单分子蛋白的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)待测蛋白与靶蛋白抗体混合，生成待测蛋白与靶蛋白抗体复合物；(2)将待测蛋白与靶蛋白抗体复合物与经标记物标记的检测抗体混合，解离收集待测蛋白和检测抗体的复合物；所述标记物为荧光素标记物或酶标记物；(3)当标记物为荧光素标记物时，将所述待测蛋白和检测抗体的复合物直接分散于微流控芯片；当标记物为酶标记物时，先将所述待测蛋白和检测抗体的复合物与酶标记物对应的底物混合反应，然后将反应液分散于微流控芯片中；(4)利用激光共聚焦检测系统对所述微流控芯片内部的液滴进行荧光信号扫描，单分子计数。

【技术特征摘要】
1.一种单分子蛋白的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)待测蛋白与靶蛋白抗体混合，生成待测蛋白与靶蛋白抗体复合物；(2)将待测蛋白与靶蛋白抗体复合物与经标记物标记的检测抗体混合，解离收集待测蛋白和检测抗体的复合物；所述标记物为荧光素标记物或酶标记物；(3)当标记物为荧光素标记物时，将所述待测蛋白和检测抗体的复合物直接分散于微流控芯片；当标记物为酶标记物时，先将所述待测蛋白和检测抗体的复合物与酶标记物对应的底物混合反应，然后将反应液分散于微流控芯片中；(4)利用激光共聚焦检测系统对所述微流控芯片内部的液滴进行荧光信号扫描，单分子计数。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述荧光素标记物为异硫氰酸荧光素、AMCA、TexasRed、TRITC、Rhodamine、R-PE、Cy3/5、DylightDyes或APC。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述酶标记物为β-半乳糖苷酶，所述酶标记物对应的底物为二半乳糖苷；或所述酶标记物为辣根过氧化物酶，所述酶标记物对应的底物为鲁米诺。4.根据权利要求1～3任一项中所述的检测方法，其特征在于，所述靶蛋白抗体偶联在磁珠上，加入标记物标记的检测抗体溶液混合孵育后去除磁珠；所述磁珠为纳米级Fe、Ni、Fe3O4或Fe2O3磁性微粒，磁珠粒径500nm-10um。5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中，当标记物为荧光素标记物时，将靶蛋白与荧光素标记物标记的检测抗体复合物溶液作为水相，于铺满油相的微流控芯片中进行液滴生成；当标记物为酶标记物时，靶蛋白与酶标记物标记的检测抗体复合物溶液与酶标记物的底物混合作为水相，于铺满油相的微流控芯片中进行液滴生成。6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述的液滴生成方法具体为将油相充满微流控芯片整个液滴存储腔；将水相通过压力泵从微流控芯片液滴形成通道道输入芯片，水相在所述微流控芯片中的台阶结构处形成舌状流体，并在剪切力的作用下形成油包水微滴落入液滴存储部件内，液滴在液滴存储腔中聚集浓缩，以多层状态铺满腔体。7.根据权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于，所述油相包括主体成分和表面活性剂，所述主体成分包括矿物油和烷烃，所述烷烃为12～16烷中的一种或其两者以上的混合物；所述表面活性剂包括EM90和TritonX-100。8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述微流控芯片包括上片、基片(6)、进样孔(4)和进样腔(10)；所述上片设置有液滴形成流道(1)和液滴存储部件(2)；所述液滴形成流道(1)与所述液滴存储部件(2)之间通过台阶结构(12)连接；所述基片(6)与所述液滴存储部件(2)之间设置有液滴存储腔(8)；所述基片(6)设置有凹槽(7)，所述凹槽(7)与所述液滴存储部件(2)紧密配合，形成液滴存储腔(8)；所述进样孔(4)、所述进样腔(10)、所述液滴形成流道(1)、所述台阶结构(12)与所述液滴存储部件(2)依次连接。9.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋小慧，位玉玲，夏江，
申请(专利权)人：领航基因科技杭州有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33