人前列腺特异性抗原检测方法及其试剂盒技术

本发明专利技术公开一种人前列腺特异性抗原检测方法及其试剂盒。本发明专利技术以人前列腺特异性抗原为检测对象，将高量子产率金纳米团簇电致化学发光技术和免疫分析技术有机结合，采用还原法制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针，以二氧化锰纳米材料作为电致化学发光猝灭剂，利用酶联免疫反应产生的抗坏血酸与二氧化锰的氧化还原反应恢复电致化学发光信号，为一种基于高量子产率金纳米团簇探针的高性能电致化学发光人前列腺特异性抗原检测方法。其对人前列腺特异性抗原检测线性范围为5×10

【技术实现步骤摘要】
人前列腺特异性抗原检测方法及其试剂盒
本专利技术涉及一种基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光人前列腺特异性抗原检测方法及其检测试剂盒，属于分析化学及纳米

技术介绍
肿瘤标志物的临床分析对于癌症的早期诊断和蛋白质组学研究至关重要，同时也加深对癌症相关的疾病生物过程的认识。人前列腺特异性抗原（prostatespecificantigen,PSA）是由前列腺上皮细胞分泌产生的一种丝氨酸蛋白酶，在大多数有临床意义的前列腺癌中都会升高，它对早期没有症状的前列腺癌的诊断很有意义。研究表明，在前列腺癌患者中，绝大部分PSA为结合状态，其游离PSA/总PSA的比值低于正常人或良性前列腺增生患者。因此，检测游离PSA，通过计算游离PSA与总PSA比值可以提高筛查和诊断前列腺癌的特异性。但是，正常的前列腺导管系统周围存在着一种血-上皮之间的屏障，避免了前列腺上皮细胞产生的PSA直接进入血液之中，且血清中的PSA几乎全部是由前列腺上皮细胞产生的，因而血液中PSA含量非常少，这在一定程度上给前列腺癌的早期诊断造成困难。目前用于检测血清中人前列腺特异性抗原含量的免疫分析方法已发展出很多种，如酶联免疫分析法、放射免疫分析法、荧光免疫分析法、化学发光免疫分析法和质谱分析等。这些方法的灵敏度十分有限，因此，亟需发展一种高灵敏度、特异性好、操作简单的方法检测人前列腺特异性抗原。电致化学发光免疫分析是近几年发展迅速的一种新型免疫检测方法，己在临床分析及医药、免疫等领域广泛应用，该技术具有操作简单、快速、选择性好、线性范围宽，及易控制等诸多优良的性能特点，并且电致化学发光技术无需激发光源、背景信号底，不但可以有效避免常规荧光分析中的光漂白和背景干扰问题，而且相比常规分析方法更为灵敏。寻找新型发光体，发展性能优良的电致化学发光体系是电致化学发光分析的重要研究方向。量子点或纳米团簇，因具有良好的光学和电学特性，在发光材料的研发、光敏传感器的构建等方面引起了越来越多的关注。在众多发光体中，金纳米团簇由于其优异的光稳定性、低毒性和良好的水溶性等，在生物标记、医学成像、生物传感器、催化和光电子学等领域被广泛应用。2011年，朱俊杰等人首次报道了金纳米团簇在过硫酸钾体系中的阴极电致化学发光现象，同年，陈国楠等人也报道了金纳米团簇在三乙胺体系中的阳极电致化学发光现象。随后，基于金纳米团簇的电致化学发光体系吸引了广大研究者们的关注。但是由于其电致化学发光强度小、量子产率低、发光机制不清楚等问题的限制，金纳米团簇在电致化学发光领域的研究还非常少。针对上述问题，本课题组通过纳米尺度调控制得了高量子产率的金纳米团簇探针新方法，并将其应用于细胞释放多巴胺的检测及小分子生物硫醇等生物分子的高灵敏、快速检测。针对临床肿瘤诊断和治疗的迫切需求，设计和制备基于新型功能化金纳米团簇的高量子产率电致化学发光免疫传感器并将其用于肿瘤标志物的检测具有较重要的学术创新性和临床应用价值。本专利技术提供了一种基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光人前列腺特异性抗原检测方法，及基于该方法制备的检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光人前列腺特异性抗原检测方法。本专利技术的另一个目的在于提供一种基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光人前列腺特异性抗原检测试剂盒。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光人前列腺特异性抗原检测方法，其特征在于：首先在电极表面修饰金纳米团簇，通过还原法制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针，并进一步在电极表面修饰二氧化锰纳米材料，将其作为电致化学发光信号猝灭剂；在空白酶标板固定人前列腺特异性抗原抗体，加入人前列腺特异性抗原，再加入生物素标记的人前列腺特异性抗原抗体，形成夹心免疫复合物；加入链霉亲和素-碱性磷酸酶，再加入2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐，通过碱性磷酸酶选择性水解2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐产生抗坏血酸；取出反应液，将电极浸入反应液中，电极表面的二氧化锰与反应液中的抗坏血酸发生氧化还原反应；采集修饰电极的电致化学发光信号，根据电致化学发光信号的改变实现人前列腺特异性抗原的检测。所述还原法制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针采用下述的电化学还原法或化学还原法制备：（1）电化学还原法：采用三电极体系进行还原，以金纳米团簇修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，将上述电极插入0.1mol/L、pH7.4磷酸盐缓冲溶液中，施加-1.4V~-2V范围内负电位电压，进行恒电位还原处理5min~1h，得到电化学发光金纳米团簇探针；（2）化学还原法：将金纳米团簇修饰玻碳电极浸泡在0.1~1mol/L硼氢化钠溶液反应5min~30min，得到化学还原法制备的金纳米团簇探针修饰电极。所述电极表面修饰二氧化锰纳米材料采用下述的电化学沉积法或滴涂法制备：（1）电化学沉积法：采用三电极体系，以还原法处理金纳米团簇修饰电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，采用I-t法，在1:1V/V的KMnO4-H2SO4溶液中，电沉积二氧化锰，沉积电位为-0.1V~-0.5V，沉积时间为100s~600s，清洗，氮气吹干；（2）滴涂法：首先制备二氧化锰纳米片，取500μL、10mmol/L的KMnO4溶液加入到1.25mL、0.1mol/L、pH6.0的缓冲溶液中，加入去离子水使溶液最后的体积成5mL后超声30min，结束后12000r.p.m离心10min，用水洗3次，重新分散于2.5mL去离子水中，得到二氧化锰纳米片溶液；取5μL滴涂于金纳米团簇修饰电极表面，自然晾干。所述在空白酶标板固定人前列腺特异性抗原抗体的方法为自组装法：取空白酶标板，在空白酶标板样品孔中加入1~5mg/mL、pH8.5的多巴胺溶液50~100μL，于4℃反应1~5h，反应结束后用水轻轻漂洗，拍干；再滴加0.1~0.5mg/mL人前列腺特异性抗原抗体溶液，4℃孵育8~12h，漂洗；加入50~100μL1wt%~5wt%的牛血清白蛋白溶液，于4℃反应0.5~2h，洗涤，拍干。所述加入人前列腺特异性抗原，再加入生物素标记的人前列腺特异性抗原抗体，形成夹心免疫复合物的方法为：在固定有人前列腺特异性抗原抗体酶标板的样品反应孔中加入人前列腺特异性抗原样本，盖上封板膜，轻轻振荡混匀，37℃温育30min~60min，洗涤，拍干；加入0.1~10μg/mL生物素标记的人前列腺特异性抗原抗体50μL，37℃温育30min~60min，洗涤，拍干。所述加入链霉亲和素-碱性磷酸酶，再加入2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐的方法为：在形成夹心免疫复合物的酶标板孔中每孔分别加入50μL的0.1~1U/mL链霉亲和素-碱性磷酸酶和5~10mmol/L2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐溶液，轻轻振荡混匀，避光反应，37℃温育30min~60min。所述采集修饰电极的电致化学发光信号方法如下：采用三电极体系进行测试，以修饰电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，缓冲溶液为磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲溶液，所用电解质为KCl或KNO3；将上述电极插入含本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光人前列腺特异性抗原检测方法，其特征在于：首先在电极表面修饰金纳米团簇，通过还原法制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针，并进一步在电极表面修饰二氧化锰纳米材料，将其作为电致化学发光信号猝灭剂；在空白酶标板固定人前列腺特异性抗原抗体，加入人前列腺特异性抗原，再加入生物素标记的人前列腺特异性抗原抗体，形成夹心免疫复合物；加入链霉亲和素‑碱性磷酸酶，再加入2‑磷酸‑L‑抗坏血酸三钠盐，通过碱性磷酸酶选择性水解2‑磷酸‑L‑抗坏血酸三钠盐产生抗坏血酸；取出反应液，将电极浸入反应液中，电极表面的二氧化锰与反应液中的抗坏血酸发生氧化还原反应；采集修饰电极的电致化学发光信号，根据电致化学发光信号的改变实现人前列腺特异性抗原的检测。

【技术特征摘要】
1.一种基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光人前列腺特异性抗原检测方法，其特征在于：首先在电极表面修饰金纳米团簇，通过还原法制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针，并进一步在电极表面修饰二氧化锰纳米材料，将其作为电致化学发光信号猝灭剂；在空白酶标板固定人前列腺特异性抗原抗体，加入人前列腺特异性抗原，再加入生物素标记的人前列腺特异性抗原抗体，形成夹心免疫复合物；加入链霉亲和素-碱性磷酸酶，再加入2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐，通过碱性磷酸酶选择性水解2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐产生抗坏血酸；取出反应液，将电极浸入反应液中，电极表面的二氧化锰与反应液中的抗坏血酸发生氧化还原反应；采集修饰电极的电致化学发光信号，根据电致化学发光信号的改变实现人前列腺特异性抗原的检测。2.根据权利要求1所述的一种基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光人前列腺特异性抗原检测方法，其特征是所述还原法制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针采用下述的电化学还原法或化学还原法制备：（1）电化学还原法：采用三电极体系进行还原，以金纳米团簇修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，将上述电极插入0.1mol/L、pH7.4磷酸盐缓冲溶液中，施加-1.4V~-2V范围内负电位电压，进行恒电位还原处理5min~1h，得到电化学发光金纳米团簇探针；（2）化学还原法：将金纳米团簇修饰玻碳电极浸泡在0.1~1mol/L硼氢化钠溶液反应5min~30min，得到化学还原法制备的金纳米团簇探针修饰电极。3.根据权利要求1所述的一种基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光人前列腺特异性抗原检测方法，其特征是所述电极表面修饰二氧化锰纳米材料采用下述的电化学沉积法或滴涂法制备：（1）电化学沉积法：采用三电极体系，以还原法处理金纳米团簇修饰电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，采用I-t法，在1:1V/V的KMnO4-H2SO4溶液中，电沉积二氧化锰，沉积电位为-0.1V~-0.5V，沉积时间为100s~600s，清洗，氮气吹干；（2）滴涂法：首先制备二氧化锰纳米片，取500μL、10mmol/L的KMnO4溶液加入到1.25mL、0.1mol/L、pH6.0的缓冲溶液中，加入去离子水使溶液最后的体积成5mL后超声30min，结束后12000r.p.m离心10min，用水洗3次，重新分散于2.5mL去离子水中，得到二氧化锰纳米片溶液；取5μL滴涂于金纳米团簇修饰电极表面，自然晾干。4.根据权利要求1所述的一种基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光人前列腺特异性抗原检测方法，其特征是所述在空白酶标板固定人前列腺特异性抗原抗体的方法为自组装法：取空白酶标板，在空白酶标板样品孔中加入1~5mg/mL、pH8.5的多巴胺溶液50~100μL，于4℃反应1~5h，反应结束后用水轻轻漂洗，拍干；再滴加0.1~0.5mg/mL人前列腺特异性抗原抗体溶液，4℃孵育8~12h，漂洗；加入50~100μL1wt%~5wt%的牛血清白蛋白溶液，于4℃反应0.5~2h，洗涤，拍干。5.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭花萍，邓豪华，黄种南，陈伟，林珍，
申请(专利权)人：福建医科大学，
类型：发明
国别省市：福建,35