结合基质的纳米囊泡及其用途制造技术

本文公开了一种组合物，其包括分离的源自ECM的纳米囊泡和药物学上可接受的载体。还公开了生产源自ECM的纳米囊泡的方法。这些源自ECM的纳米囊泡可包含在药物组合物、生物骨架和装置中。提供了应用这些源自ECM的纳米囊泡的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】结合基质的纳米囊泡及其用途相关领域的交叉申请本专利技术要求2016年3月2日提交的美国临时专利申请62/302,626的权益，其通过引用并入本文。专利
本专利技术涉及生物骨架领域，尤其涉及源自细胞外基质(ECM)的纳米囊泡及其用途。专利技术背景由细胞外基质(ECM)构成的生物骨架已被开发作为外科用网状材料，并且可被允许用于许多临床应用中，包括腹疝修复(Alicuban等，Hernia.2014；18(5):705-712)、肌肉骨骼重建(Mase等，Orthopedics.2010；33(7):511)、食管重建(Badylak等，TissueEngPartA.2011；17(11-12):1643-50)、硬脑膜置换(Bejjani等，JNeurosurg.2007；106(6):1028-1033)、肌腱修复(Longo等，StemCellsInt.2012；2012:517165)、乳房再造(Salzber,AnnPlastSurg.2006；57(1):1-5)、其他(Badylak等,ActaBiomater.2009；5(1):1-13)。这些材料的使用通常与至少部分恢复功能化的部位适宜的组织(称为“建构性重塑”的过程)有关。这些基于ECM的材料是最常见的异种来源(例如，用于人类宿主的猪)物质，并且可通过对源组织如真皮、膀胱(UBM)和小肠粘膜下层(SIS)等去细胞化来制备。这些异源骨架并不会产生不利的先天或适应性免疫应答(Badylak等，AnnBiomedEng.2014；42(7):1517-1527)。确定在临床应用中的结果的因素有多种，包括手术技术、所选择的生物骨架对临床状况的适宜性、同种异体或异种组织源供体的年龄、患者的共存病症等(Badylak等,AnnBiomedEng.2014；42(7):1517-152)。或许，结果的主要确定因素是加工这些生物骨架的方法，包括去细胞化技术、终端灭菌法和水合的状态(Badylak等，AnnBiomedEng.2014；42(7):1517-152)。已显示出，不足的去细胞化、使用化学交联剂和缺少体内置换后适宜的机械加载有助于产生不良的结果(Badylak等，AnnBiomedEng.2014；42(7):1517-1527；Crapo等，Biomaterials.2011；32(12):3233-43)。使用特殊生物骨架的结果取决于移植后响应于最终产物(例如，后加工)的宿主组织。在诱导的与ECM有关的宿主应答的不同组分之中，部位适宜的结构性和功能性的组织重塑为血管生成、神经分布、干细胞召集、抗微生物学活性和先天免疫应答的调制(LondonoandBadylak,AnnBiomedEng.2015；43(3):577-592)。此外，同源与异源应用之间存在明显差异。例如，由肝ECM构成的ECM生物骨架支持肝窦内皮细胞表型，而从异源组织和器官收获的ECM则不支持(Sellaro等，TissueEng.2007；13(9):2301-2310)。相似地，肺ECM可促进部位适宜的干细胞分化(Coriella等，TissueEngPartA.2010；16(8):2565-2580)。细胞与ECM之间存在明显的“串扰”，但ECM发信号并指引细胞行为的机制在很大程度上是未知的，反之亦然。仍然需要鉴定这些效应的成分和机制和利用这些效应，以便ECM可被生物操作用于特定的应用。一旦鉴定了这些成分和机制，那么就可操作这些成分和机制用于医疗装置，并且可以这种方式实施这些成分和机制以影响细胞增殖、存活和分化。
技术实现思路
本文公开了包埋在ECM的原纤维网中的纳米囊泡。这些结合基质的纳米囊泡可使其装载物在ECM骨架的制造过程中免于降解和变性。先前已鉴定出，微米囊泡几乎仅存在于体液和细胞培养上清液中。因此，令人惊讶的是存在结合基质的纳米囊泡。这些纳米囊泡不同于其他微囊泡，因为纳米囊泡对清洁剂和/或酶消化有抗性，这些纳米囊泡包含一簇不同的microRNA，并且富含miR-145。所公开的纳米囊泡不含有在其他微囊泡中发现的特征性表面蛋白质。纳米囊泡可提供独一无二的可用于生物骨架和装置中的生物学特性。本文公开了一种组合物，其包含源自ECM的分离的纳米囊泡和药物学上可接受的载体。在某些实施方案中，纳米囊泡不表达CD63或CD81，或者为CD63loCD81lo。在另外的实施方案中，公开了分离与细胞外基质结合的纳米囊泡的方法。这些方法包括但不限于用酶消化细胞外基质，产生经消化的细胞外基质；离心所述经消化的细胞外基质以去除胶原原纤维残留，从而产生无原纤维上清液；离心所述无原纤维上清液以分离固态物料；以及将固态物料悬浮于载体中；和使用各种盐以从细胞外基质分离纳米囊泡。在进一步的实施方案中，公开了在感兴趣的细胞外基质上诱导细胞增殖、迁移和/或分化的方法。这些方法利用了所公开的纳米囊泡。所述方法可包括将源自第二细胞外基质的分离的纳米囊泡引入至感兴趣的细胞外基质中。在其他的实施方案中，公开了生物骨架，其包含源自细胞外基质的分离的纳米囊泡。在进一步的实施方案中，公开了医疗装置，其包含和/或包覆有源生自细胞外基质的分离的纳米囊泡。通过以下详细描述，本专利技术的前述和其他目的、特征和优点将变得更加明显，参考附图进行所述详细描述。附图说明图1A-1C。比较来自UBM、SIS或真皮以及可商购的等效物的核酸浓度。来自(A)UBM、(B)SIS和(C)真皮样本的未消化和蛋白酶K或胶原酶消化的样本中每毫克干重ECM骨架的总核酸和双链DNA的浓度。通过由260nm处的UV吸光度测定总核酸浓度。由picogreen双链DNA定量试剂测定双链DNA浓度。由标准偏差描述分离与分离之间的差异。数据以平均数±标准差(s.d)表示，每个样本中，n＝3个分离。图2A-2D。去细胞化的ECM骨架的酶消化释放小RNA分子。(A)RNaseA处理的、DNaseI处理的或未处理的从未消化的UBM(对照)和蛋白酶K或胶原酶消化物中提取的核酸的琼脂糖凝胶电泳。(B)描述在DNaseI处理前(上幅)和后(下幅)从胶原酶消化的UBM中提取的核酸的小RNA模式(pattern)的电泳图。(C)描述在DNaseI处理后来自胶原酶消化的样本的小RNA模式的电泳图。(D)生物骨架中的小RNA分子受保护而免受核酸酶降解。图3A-3F。ECM包埋的纳米囊泡的鉴定。鉴定了圆形结构的锇染色阳性的水合UBM的TEM成像(A)。用胃蛋白酶进行的酶消化导致部分消化，因为MBV陷于纤维内。用胶原酶或蛋白酶K进行的完全消化导致MBV与ECM纤维的完全分离，这在TEM成像中是明显的(B)。来自三种可商购和实验室生产的产品的蛋白酶-K消化的ECM(100mg)(C)揭示了在所有样本中存在包埋于ECM内的MBV。采用ECM产物的SDS凝胶电泳银染色评价MBV蛋白货物标记。每个样本的蛋白标记不同(D)。对两种核外表面标记物CD-63和CD-81进行Western印记分析。与人骨髓来源的间质干细胞和人血清对照相比，表达水平不可检测(E)。经Nanosight确认MBV尺寸。颗粒尺寸与MBV一致(F)。数据以平均值±标准差(s.d)表示，n＝1。图4A-4C。小RNA测序本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种组合物，包含源自细胞外基质的分离的纳米囊泡和药物学上可接受的载体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.03.02 US 62/302,6261.一种组合物，包含源自细胞外基质的分离的纳米囊泡和药物学上可接受的载体。2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述纳米囊泡不表达CD63或CD81，或者为CD63loCD81lo。3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述细胞外基质为哺乳动物细胞外基质。4.根据权利要求2所述的组合物，其中所述哺乳动物细胞外基质为人细胞外基质。5.根据权利要求1-3中任意一项所述的组合物，其中所述细胞外基质来自食道组织、膀胱、小肠粘膜下层、真皮、脐带、心包、心脏组织、肿瘤组织或骨骼肌。6.根据权利要求1-5中任意一项所述的组合物，其中所述纳米囊泡包含miR-145和/或miR-181。7.根据权利要求1-6中任意一项所述的组合物，其中用酶消化所述细胞外基质。8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述酶为胃蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶或蛋白酶K。9.根据权利要求1-8中任意一项所述的组合物，其中所述载体包含缓冲液、凝胶、防腐剂和/或稳定剂。10.根据权利要求1-9中任意一项所述的组合物，还包含外源治疗剂。11.根据权利要求9所述的组合物，其中所述治疗剂为化学化合物、核酸分子、多肽、生长因子、细胞因子或小分子。12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述治疗剂为microRNA或蛋白质。13.一种从细胞外基质分离纳米囊泡的方法，包括：用酶消化所述细胞外基质，产生经消化的细胞外基质；离心所述经消化的细胞外基质以去除胶原原纤维残留，从而产生无原纤维的上清液；离心所述无原纤维的上清液以分离固体材料；以及将所述固体材料悬浮于载体中，从而从所述细胞外基质分离纳米囊泡。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述酶为胃蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶或蛋白酶K。15.根据权利要求13或14所述的方法，其中离心所述经消化的细胞外基质包括以大约300g至大约1000g离心大约10分钟至大约15分钟、以大约2000g至大约3000g离心大约20分钟至大约30分钟和以大约10,000g至大约15,000g离心大约25分钟至大约40分钟。16.根据权利要求15所述的方法，其中离心经所述消化的细胞外基质包括以大约500g离心大约10分钟、以大约2,500g离心大约20分钟，和/或以大约10,000g离心大约30分钟。17.根据权利要求13-16中任意一项所述的方法，其中重复离心所述经消化的细胞外基质至少两次或三次。18.根据权利要求13-17中任意一项所述的方法，其中离心所述无纤维上清液包括以大约100,000g至大约150,000g离心大约60分钟至大约90分钟。19.根据权利要求13-18中任意一项所述的方法，其中离心所述无纤维上清液包括以大约100,000g离心大约70分钟。20.根据权利要求13-19中任意一项所述的方法，其中所述细胞外基质为哺乳动物细胞外基质。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述哺乳动物细胞外基质为人细胞外基质。22.根据权利要求13-21中任意一项所述的方法，其中所述细胞外基质分离自食管组织、膀胱、小肠粘膜下层、真皮、脐带、心包、心脏组织或骨骼肌。23.一种改变感兴趣的细胞外基质上的细胞增殖、迁移和/或分化的方法，包括：将源自第二细胞外基质的分离的纳米囊泡引入至所述感兴趣的细胞外基质，从而改变所述基质的细胞增殖、迁移和/或分化。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述感兴趣的细胞外基质和所述第二细胞外基质来自相同的物种。25.根据权利要求23所述的方法，其中所述感兴趣的细胞外基质和所述第二细胞外基质来自不同的物种。26.根据权利要求23-25中任意一项所述的方法，其中所述感兴趣的细胞外基质和所述第二细胞外基质来自不同的组织。27.根据权利要求23-26中任意一项所述的方法，其中所述感兴趣的细胞外基质和所述第二细胞外基质来自相同的组织。28.根据权利要求23-27中任意一项所述的方法，其中所述感兴趣的细胞外基质和所述第二细胞外基质是人的。29.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·F·巴迪拉克，L·胡莱赫尔，G·S·赫西，J·D·纳兰霍古铁雷斯，
申请(专利权)人：高等教育联邦系统匹兹堡大学，
类型：发明
国别省市：美国,US