一种高灵敏度高特异性错配核酸序列的设计方法技术

本发明专利技术公开了一种高灵敏度高特异性错配核酸序列的设计方法，通过计算错配序列和目标序列和同源干扰序列的ΔMFE值，确定候选错配核酸序列。本发明专利技术的方法，避免了错配核酸序列设计依赖于经验，大大减少了错配核酸序列，特别是错配引物的设计工作量，可以快速从大量错配核酸序列中获得少量的候选核酸序列，有利于从少量候选核酸序列中确定最佳的核酸序列。基于本方法设计的错配引物，在目标序列浓度低时，依然可以与目标序列保持较高的亲和力，同时与干扰同源序列的亲和力较差，有效提高了目标序列的扩增灵敏度，可以更好地用于高度同源核酸序列，特别是miRNA的扩增。

A Design Method of Mismatched Nucleic Acid Sequences with High Sensitivity and Specificity

The invention discloses a design method of high sensitivity and high specificity mismatched nucleic acid sequence, and determines candidate mismatched nucleic acid sequence by calculating the MFE value of mismatched sequence and target sequence and homologous interference sequence. The method of the present invention avoids relying on experience in the design of mismatched nucleic acid sequences, greatly reduces the design workload of mismatched nucleic acid sequences, especially mismatched primers, can quickly obtain a small number of candidate nucleic acid sequences from a large number of mismatched nucleic acid sequences, and is conducive to determining the best nucleic acid sequences from a small number of candidate nucleic acid sequences. The mismatched primers based on this method can still maintain high affinity with target sequences at low concentration, and have poor affinity with interfering homologous sequences, which effectively improves the amplification sensitivity of target sequences and can be better used for the amplification of highly homologous nucleic acid sequences, especially for the amplification of microRNAs.

【技术实现步骤摘要】
一种高灵敏度高特异性错配核酸序列的设计方法
本专利技术涉及一种高灵敏度高特异性错配核酸序列的设计方法。
技术介绍
为定量目标核酸序列的量，往往需要对目标核酸序列进行扩增。在核酸序列的扩增中，引物对扩增的结果有着至关重要的影响。设计合理的引物不仅可以有效提高扩增效率，更要提高扩增的特异性。反之，设计不当的引物，不仅扩增效率较差，特异性也相对较差。在引物的扩增特异性较差时，会扩增出非目标序列，扩增的结果往往是不可靠的，会出现假性结果。一般的引物设计规则是根据扩增的反应条件，设计尽可能互补的序列，以提高扩增效率，同时减少非特异性扩增的产生。然而在序列同源性极高的情况下，这种引物设计规则基本是失效的，需要使用特别设计引物。以同源家族序列的定量检测为例，同源家族序列的相似度极高，一般只存在1～3个碱基的差别。以MicroRNA(miRNA)为例，miRNA是一类内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA，在动植物中能参与转录后基因表达调控。在特定细胞、组织，以及生命发育阶段中，miRNA发生特异性表达，说明该类miRNA在其中可能行使某些调控功能并带来相应的响应与变化。对于miRNA的灵敏检测，对疾病的诊断、治疗和预后均有重要意义。但由于miRNA序列短，表达量低且具有时空差异性，易降解，同源家族序列相似度极高(1-3个碱基差别)，准确定量检测难度大。当前，miRNA的定量分析大多基于碱基互补的链杂交原理实现。方法主要分两类：1)基于探针杂交的方法，包括RNA印迹技术、原位杂交技术、微阵列技术等。该类方法可直接检测miRNA而无需扩增，但灵敏度较低。2)基于扩增的方法，包括茎环引物逆转录聚合酶链式反应、RNA加尾法、引物延伸RT-PCR、引物浸入法、测序法等。当待测miRNA浓度较高时，方法具有优越的灵敏度与特异性。但对于低浓度、存在大量竞争性同源序列的样品时，极易出现假阳性，难以超灵敏准确检测，甚至会覆盖真实的目标链信号。为提高高度同源序列的扩增灵敏度和特异性，人们开发出了不同的方法，部分方法如下：黄可.引物和探针核苷酸错配对PCR灵敏度和特异性影响的研究[D].扬州大学,2017.的研究结果表明，在引物3'端发生核苷酸错配时，不同DNA聚合酶的效率有差别，PlatinumDNA聚合酶比TakaraDNA聚合酶的特异性更强，而TakaraDNA聚合酶的灵敏度更高，能够容忍较多的错配；引物3'端由G变为C和由T变为G时对PCR扩增效率影响最大；错配发生在距离3'端4个碱基或发生在5'端(能容忍连续8个错配)和中间时，对扩增效率的影响不大；上下游引物除3'端以外的其它位点错配在错配数量达到10个时仍然能有扩增反应。探针核苷酸在中间发生错配时对扩增效率的影响较大，能容忍的错配个数为5个核苷酸。本研究关于引物设计的实际应用表明:基于上述结论所建立的PCR方法可特异性地区分诊断巴贝斯虫和泰勒虫，这将为在临床情况下区分诊断类似于像巴贝斯虫与泰勒虫这种基因同源性较高的病原体提供了重要的参考依据。但关于错配延伸的相关机制目前尚不明确，对其进行更深入的研究将为引物和探针的设计提供更多的参考价值。李金春,李家鹏,周彤,等.引物3’端不同碱基错配情况下实时荧光定量PCR非特异性扩增的发生规律[J].食品科学,2017,38(10):277-283.以错配反应与正常反应之间的△Ct值为指示,研究不同碱基错配类型、位置与个数条件下引物3'端与模板之间非特异性扩增的发生规律,并构建△Ct值的二次多项式回归模型.结果表明,碱基错配种类、位置、个数对实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitativereal-timepolymerasechainreaction,RT-qPCR)的非特异性扩增都有显著影响,并呈现出较强的规律性.碱基类型上,研究的各个位置上异型错配较易发生非特异性扩增,而同型错配则较难发生,并且两种错配类型之间有显著性差异(P＜0.05)；错配位置上,相同条件下引物3'端第1位碱基错配对△Ct值影响最大,错配位置远离3'端时对△Ct值的影响逐渐减小,非特异性扩增也更容易发生；错配个数上,随着错配碱基个数的增加对△Ct值得影响程度不断增大,非特异性扩增较难发生.构建△Ct值预测模型R2达到0.8371,根据此模型可以预测出不同位置、不同错配类型条件下△Ct值,从而可以判断RT-qPCR非特异性扩增的发生的难易程度.何湘君,张旗,刘玉京,等.通过引物设计和提高退火温度提高实时定量PCR检测microRNA的特异性[J].北京大学学报(医学版),2009,41(6):691-698.采用RNA加尾和引物延伸实时定量RT-PCR法,设计不同位置错配的引物,以克隆到质粒中的全长成熟miRNA为模板,比较在不同退火温度下各种错配核酸序列与完全匹配引物在扩增miRNA上的效率差异,并根据由此得出的经验设计let-7家族成员引物,以克隆的成熟miRNA为模板,检测其在不同退火温度下区分相似家族成员的能力.此外,设计了10组3'末端碱基位置不同的特异引物,比较了它们在检测小鼠大脑miRNA表达水平上的差异.结果:提高退火温度12℃～14℃将最大限度增加特异性而不降低敏感性,将引物的3'末端置于差异碱基或其附近可以有效区分相似miRNA序列,将引物3'末端置于miRNA第18～20个碱基,可避免漏检较短的成熟miRNA,使定量更真实准确.结论:精心设计引物并提高退火温度可提高实时定量PCR检测microRNA的特异性和准确性。上述方法在一定程度上可以解决高度同源序列扩增灵敏度和特异性低的问题，但是其方法严重依赖于个人经验，结果往往不可扩展到其他高度同源序列的扩增中。开发出一种通用性好的高灵敏度高特异性错配核酸序列的设计方法，对高度同源序列，特别是短序列的miRNA的扩增有着非常重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种通用性好，对度同源序列，特别是短序列的miRNA的扩增具有高灵敏度高特异性的引物设计方法。本专利技术所采取的技术方案是：一种错配核酸序列的设计方法，包括如下步骤：1)确定目标序列和竞争性同源序列；2)基于核酸序列二级自由能，通过MFE公式计算随机错配核酸序列与目标序列和竞争性同源序列的最小二级结构自由能MFE；3)分别计算错配核酸序列与目标序列和竞争性同源序列的最小二级结构自由能MFE的差值，记为ΔMFE；4)基于ΔMFE值，确定候选错配核酸序列。作为上述设计方法的进一步改进，错配核酸序列为错配扩增引物和/或用于结合竞争性同源序列的掩蔽核酸序列。作为上述设计方法的进一步改进，最小二级结构自由能MFE使用NUPACK计算得到。作为上述设计方法的进一步改进，随机错配核酸序列中与目标序列的碱基错配数不超过3个。作为上述设计方法的进一步改进，候选错配核酸序列为ΔMFE值的极大值和/或极小值的前15％。作为上述设计方法的进一步改进，作为错配扩增引物使用的候选错配核酸序列与目标序列最小二级结构自由能MFE不高于0.7kcal/mol。作为上述设计方法的进一步改进，目标序列的长度为20～24bp。一种竞争性同源核酸序列的扩增方法，包括如下步骤：1)按上述的方法得到候选错配核酸序列；2)使用候选错配核酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种错配核酸序列的设计方法，包括如下步骤：1)确定目标序列和竞争性同源序列；2)基于核酸序列二级自由能，通过MFE公式计算随机错配核酸序列与目标序列和竞争性同源序列的最小二级结构自由能MFE；3)分别计算错配核酸序列与目标序列和竞争性同源序列的最小二级结构自由能MFE的差值，记为ΔMFE；4)基于ΔMFE值，确定候选错配核酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种错配核酸序列的设计方法，包括如下步骤：1)确定目标序列和竞争性同源序列；2)基于核酸序列二级自由能，通过MFE公式计算随机错配核酸序列与目标序列和竞争性同源序列的最小二级结构自由能MFE；3)分别计算错配核酸序列与目标序列和竞争性同源序列的最小二级结构自由能MFE的差值，记为ΔMFE；4)基于ΔMFE值，确定候选错配核酸序列。2.根据权利要求1所述的设计方法，其特征在于：错配核酸序列为错配扩增引物和/或用于结合竞争性同源序列的掩蔽核酸序列。3.根据权利要求1所述的设计方法，其特征在于：最小二级结构自由能MFE使用NUPACK计算得到。4.根据权利要求1～3任一项所述的设计方法，其特征在于：随机错配核酸序列中与目标序列的碱基错配数不超过3个。5.根据权利要求3所述的设计方法，其特征在于：作为错配扩增引物使用的候选错配核酸序列与目标序列最小二级结构自由能MFE不高于0.7kcal/mol。6.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴宗，徐梦菲，陈俊，王洋，邹小勇，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东,44