一种制备二代测序接头的方法技术

本发明专利技术提供一种制备二代测序接头的方法，包括：步骤一：合成接头序列，接头序列包含第一序列和第二序列，其中，所述第二序列包括：限制性内切酶的保护碱基、随机碱基的双链分子标签，步骤二：接头序列退火，混匀第一序列和第二序列，在退火体系中按退火程序退火形成双链，步骤三：补齐步骤二中所形成的双链的接头，步骤四：酶切回收3’‑dT尾接头。本发明专利技术的制备二代测序接头的方法，具有以下优势：接头中含有更长的双链分子标签，为生信分析提供更好的信息基础；可以有效、较经济实惠地合成获得；适用于多种测序平台。

【技术实现步骤摘要】
一种制备二代测序接头的方法
本专利技术涉及一种制备二代测序接头的方法，属于分子生物学领域。
技术介绍
在Illumina测序平台中，接头是二代测序建库中必要的元素，目前官方的接头包含多种类型，序列中包含了p5与p7扩增引物结合序列、read1和read2测序引物结合序列、样本标签序列、分子标签序列等，并且带有用于A/T连接的3’-dT尾。目前常于p7端设计单链分子标签用于给建库中的目标分子添加标签，使生信分析过程可以捕获到更精细的分子信息，降低变异分析的背景噪音。另外，也可以通过双链分子标签，结合单链分子标签，通过生信将变异分析的背景噪音降得更低，使测序分析结果更加精准可靠。但是，目前没有较好的双链标签添加方法方便于文库构建。1、目前接头通常不含单链分子标签、或仅含有单链分子标签二不含双链标签，生物信息分析降噪效果有限；2、如Capp-Seq技术中含有双链标签，但是标签数较低，对生物信息分析的改进有限。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种制备二代测序接头的方法，以解决上述问题。本专利技术采用了如下技术方案：一种制备二代测序接头的方法，其特征在于，包括：步骤一：合成接头序列，接头序列包含第一序列和第二序列，其中，所述第二序列包括：限制性内切酶的保护碱基和随机碱基的双链分子标签，步骤二：接头序列退火，混匀第一序列和第二序列，在退火体系中按退火程序退火形成双链，步骤三：补齐步骤二中所形成的双链的接头，步骤四：酶切回收接头，第一序列的序列如下：5-A*A*TGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC-GCTCTTCCGAT*C*T-3，第二序列的序列如下：5-NNNNANNNNCCCAGTAG*A*TCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNN-NNNNNNNN-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCT*T*G-3，第二序列中，第1至4位为限制性内切酶的保护碱基，第6位至第9位是四个随机碱基的双链分子标签，第50位至第53位是四个随机碱基的单链分子标签，第54位至第61位是6-8个碱基的样本标签。进一步，本专利技术的制备二代测序接头的方法，还具有这样的特征：其中，所述第二序列中还具有随机碱基的单链分子标签。进一步，本专利技术的制备二代测序接头的方法，还具有这样的特征：其中，所述第二序列中还具有样本标签。进一步，本专利技术的制备二代测序接头的方法，还具有这样的特征：其中，所述第二序列中还具有限制性内切酶BmrI的酶切位点。进一步，本专利技术的制备二代测序接头的方法，还具有这样的特征：步骤三中，采用T4DNA聚合酶延伸补平步骤二中的退火产物。进一步，本专利技术的制备二代测序接头的方法，还具有这样的特征：步骤四中，采用限制性内切酶BmrI酶切步骤三中的延伸产物，并采用上海翊圣生物科技有限公司的HieffNGS™SmarterDNACleanBeads纯化回收接头，去除50bp以内的残余双链小片段，保留接头。专利技术的有益效果本专利技术的制备二代测序接头的方法，具有以下优势：1.接头中含有更长的双链分子标签，为生信分析提供更好的信息基础；而现有的产品通常不带双链分子标签、罗氏的带2bp的双链分子标签。2.可以有效、较经济实惠地合成获得；3.适用于IlluminaHi-Seq、Mi-Seq等测序平台。具体实施方式以下通过具体实例来说明本专利技术的具体实施方式。步骤一：合成接头序列。合成以下两种序列：序列1：5-A*A*TGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC-GCTCTTCCGAT*C*T-3序列2：5-NNNN-ANNNNCCCAGT-AG*A*TCGGAAGAGC-ACACGTCTGAACTCCAGTCAC-NNNN-NNNNNNNN-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCT*T*G-3序列中“*”为保护性修饰；第1至第4位的碱基为限制性内切酶的保护碱基，在其它的实施方式中，5’端的保护性碱基，可选的碱基数为0-10个，具体碱基可变，具体根据实际案例设计而定；第6位至第9位是四个随机碱基的双链分子标签，第50位至第53位是四个随机碱基的单链分子标签，第54位至第61位是6-8个碱基的样本标签。每次合成固定碱基的序列，次序列可变；第10位至第15位的碱基为限制性内切酶BmrI的酶切位点。步骤二：接头序列退火。步骤三：延伸补齐接头。采用T4DNA聚合酶延伸补平步骤二中的退火产物。步骤四：酶切回收3’-dT尾接头。采用限制性内切酶BmrI酶切步骤三中的延伸产物，并采用上海翊圣生物科技有限公司的HieffNGS™SmarterDNACleanBeads纯化回收接头，去除50bp以内的残余双链小片段，保留接头。双链分子标签接头制备示例：1、合成接头序列：序列1：5-A*A*TGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC-GCTCTTCCGAT*C*T-3序列2：5-TTTC-ANNNNCCCAGT-AG*A*TCGGAAGAGC-ACACGTCTGAACTCCAGTCAC-NNNN-NNNNNNNN-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCT*T*G-32、接头序列退火：1:1混匀序列1和序列2，在退火体系中按退火程序退火形成双链，形成以下结构：3、延伸补齐接头：利用T4DNA聚合酶延伸补齐接头序列，如下：4、酶切回收3’-dT尾接头：利用BmrI限制性内切酶酶切上述接头，并利用上海翊圣生物科技有限公司的HieffNGS™SmarterDNACleanBeads纯化回收接头，接头如下：本专利技术所提供的接头制备方法，回收效率在40%~80%。序列表<110>翌圣生物科技(上海)有限公司<120>一种制备二代测序接头的方法<160>6<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>58<212>DNA<213>Artificialsequence<400>1aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct58<210>2<211>85<212>DNA<213>Artificialsequence<220><221>misc_feature<222>(1)..(4)<223>nisa,c,g,ort<220><221>misc_feature<222>(6)..(9)<223>nisa,c,g,ort<220&am本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备二代测序接头的方法，其特征在于，包括：步骤一：合成接头序列，接头序列包含第一序列和第二序列，其中，所述第二序列包括：限制性内切酶的保护碱基和随机碱基的双链分子标签，步骤二：接头序列退火，混匀第一序列和第二序列，在退火体系中按退火程序退火形成双链，步骤三：补齐步骤二中所形成的双链的接头，步骤四：酶切回收接头，第一序列的序列如下：5‑A*A*TGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC‑GCTCTTCCGAT*C*T‑3，第二序列的序列如下：5‑NNNNANNNNCCCAGTAG*A*TCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNN‑NNNNNNNN‑ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCT*T*G‑3，第二序列中，第1至4位为限制性内切酶的保护碱基，第6位至第9位是四个随机碱基的双链分子标签，第50位至第53位是四个随机碱基的单链分子标签，第54位至第61位是6‑8个碱基的样本标签。

【技术特征摘要】
1.一种制备二代测序接头的方法，其特征在于，包括：步骤一：合成接头序列，接头序列包含第一序列和第二序列，其中，所述第二序列包括：限制性内切酶的保护碱基和随机碱基的双链分子标签，步骤二：接头序列退火，混匀第一序列和第二序列，在退火体系中按退火程序退火形成双链，步骤三：补齐步骤二中所形成的双链的接头，步骤四：酶切回收接头，第一序列的序列如下：5-A*A*TGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC-GCTCTTCCGAT*C*T-3，第二序列的序列如下：5-NNNNANNNNCCCAGTAG*A*TCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNN-NNNNNNNN-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCT*T*G-3，第二序列中，第1至4位为限制性内切酶的保护碱基，第6位至第9位是四个随机碱基的双链分子标签，第50位...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑贤杰，朱垚，曹振，袁慧艳，宋东亮，
申请(专利权)人：翌圣生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31