利用密西根克雷伯氏菌合成2’-脱氧-2-氨基腺苷的方法技术

本发明专利技术公开了利用密西根克雷伯氏菌合成2'‑脱氧‑2‑氨基腺苷的方法，属于生物发酵技术领域。该工艺利用密西根克雷伯氏菌为菌种，利用该菌株湿菌体为酶源将胸苷和2,6‑二氨基嘌呤一步转化为2'‑脱氧‑2‑氨基腺苷。与其他工艺相比，本发明专利技术反应体系为纯化水、合成液中各个组分明确，利用该方法得到的2'‑脱氧‑2‑氨基腺苷易提取，产品质量高，成本低廉且易操作适合工业化，成品含量≥99.9%，具有明显市场竞争力。

Synthesis of 2'-Deoxy-2-Aminoadenosine by Klebsiella Michigan

The invention discloses a method for synthesizing 2'deoxy adenosine by Klebsiella michigan, which belongs to the technical field of biological fermentation. In this process, Klebsiella Michigan was used as strain and the wet bacteria were used as enzyme source to convert thymidine and 2,6 diaminopurine into 2'deoxy 2 adenosine in one step. Compared with other processes, the reaction system of the present invention is characterized by clear components in purified water and synthetic solution, easy extraction of 2'deoxy 1089

【技术实现步骤摘要】
利用密西根克雷伯氏菌合成2’-脱氧-2-氨基腺苷的方法
本专利技术属于生物医药中生物发酵
，涉及嘌呤脱氧核苷的生物合成，具体涉及利用密西根克雷伯氏菌合成2'-脱氧-2-氨基腺苷的方法。
技术介绍
克雷伯氏菌属(Klebsiella)为革兰氏阴性杆菌。主要有肺炎克雷伯氏菌(K.peneumoniae)、臭鼻克雷伯氏菌(K.ozaenae)和鼻硬结克雷伯氏菌(K.rhinoscleromatis)。生物学性状：为较短粗的杆菌，大小0.5-0.8×1-2um,单独、成双或短链状排列。无芽胞，无鞭毛，有较厚的荚膜，多数有菌毛。营养要求不高，有普通琼脂培养基上形成较大的灰白色粘液菌落，以接种环挑之，易拉成丝，有助鉴别。在肠道杆菌选择性培养基上能发酵乳糖，呈现有色菌落。具有O抗原与K抗原，后者用以分型。利用荚膜肿胀试验，本属K抗原可分为82型。肺炎克氏菌大多属3型和12型；臭鼻克氏菌主要属4型，少数为5型或6型；鼻硬结克氏菌一般属3型，但并非所有3型均为该菌。本属细菌在55℃、30分钟内被杀死，在培养基上可存活数周至数月。2'-脱氧-2-氨基腺苷(dDA)简称2-氨基脱氧腺苷，是精细化工、农药和医药的重要中间体，特别在医药领域，主要用于合成抗艾滋病、抗癌、治疗高血压等方面药物，应用非常广泛。其合成方法主要为化学合成法，采用生物合成从胸苷和2,6-二氨基嘌呤直接转化为2'-脱氧-2-氨基腺苷仍然没有突破性进展。
技术实现思路
为了克服上述缺陷，本专利技术工艺采用密西根克雷伯氏菌为菌种，利用该菌株湿菌体为酶源将胸苷和2,6-二氨基嘌呤转化为2'-脱氧-2-氨基腺苷，工艺简单，成本低廉且易操作适合工业化。本专利技术技术方案转化过程包括：菌体制备、固定化酶制备、酶促反应和产品提取等四个过程。详细工艺流程如图1所示。微生物信息：本专利技术所采用密西根克雷伯氏菌，其拉丁名为以及具体实施方式所使用的密西根克雷伯氏菌(Klebsiellamichiganensis)已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.16111。保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2018年07月16日。一、菌体制备1.1菌体活化及产酶培养菌种：Klebsiellamichiganensis(密西根克雷伯氏菌)菌株编号：DUR201505001菌株保藏号：CGMCC16111活化培养基：酵母膏5g/L、氯化钠10g/L、蛋白胨10g/L、pH7.0培养条件：38℃、200rpm、12h产酶培养基：酵母膏75g/L、氯化钠15g/L、玉米浆60mL/L、氯化钙0.8g/L、七水硫酸镁0.6g/L、一水硫酸锰0.8g/L、氯化锌0.1g/L、pH7.0培养条件：38℃、DO≥50％、14h1.2菌体收集产酶培养液离心处理，然后湿菌体用pH7.0、20mmol/L的磷酸二氢钾缓冲液洗涤，离心所得湿菌体-20℃冷冻保存备用。二、固定化酶制备2.1提酶利用超声波细胞破碎法处理菌悬液，离心上清即酶液。超声处理条件：菌悬液配方：Tris-Hcl50mN、EDTA5mN、pH8.0、菌体浓度60％破碎条件：1600W、35℃、30min离心条件：7000rpm、30min2.2活化树脂(1)水洗称量适量的新树脂用纯化水洗至无混浊(5-8次)，然后抽滤后用适量PBS缓冲液浸泡5-10h。(2)戊二醛交联抽滤除掉PBS缓冲液，然后加入10倍体积的0.5％戊二醛溶液，25℃水浴搅拌12-15h。(3)水洗交联后的树脂抽滤出去戊二醛溶液，然后用纯化水洗干净后待用。2.3酶联活化树脂与酶量按照1:1.5比例混匀，20℃水浴搅拌12-15h，然后水洗至中性待用。三、酶促反应3.1反应体系配制胸苷50-200g/L；2,6-二氨基嘌呤50-200g/L；固定化酶量50-200g/L；反应体系：纯化水3.2反应条件待反应体系配制完成以后200rpm搅拌，55-65℃水浴反应72h，然后，抽滤得合成液，进行下一步提取工序。四、产品提取4.1浓缩酶促反应结束后，抽滤得2'-脱氧-2-氨基腺苷(dDA)合成液，旋蒸浓缩得粗品。4.2热溶检测粗品中产物含量，按照粗品中2'-脱氧-2-氨基腺苷含量用适量碱乙醇热溶，抽滤后得粗品溶液。4.3干燥将粗品溶液旋蒸干燥得到2'-脱氧-2-氨基腺苷粗品。4.4精制根据粗品中杂质含量，将2'-脱氧-2-氨基腺苷粗品溶于适量的碱水溶液中，然后抽滤得沉淀，干燥后得2'-脱氧-2-氨基腺苷纯品。进一步地，在上述技术方案中，该工艺反应体系为纯化水，以胸苷和2,6-二氨基嘌呤为底物一步合成目标产物2'-脱氧-2-氨基腺苷，成本低廉环保易操作适合工业化。进一步地，在上述技术方案中，提取工序中，该工艺该工艺产物积累浓度最高达450mmol/L以上，固定化酶与反应液易分离，产物易提取，收率高(≥90％)。专利技术有益效果1)酶促工序菌种：该工艺首次利用密西根克雷伯氏菌为菌种，利用该菌株湿菌体为酶源转化胸苷和尿嘧啶合成脱氧尿苷，工艺简单，成本低廉且易操作适合工业化。反应体系：该工艺使用的反应体系为纯化水(参考文献中是利用PBS和Tris-HCl)，以胸苷和2,6-二氨基嘌呤为底物酶促合成目的产物2'-脱氧-2-氨基腺苷，成本低廉环保易操作适合工业化。固定化酶：该工艺利用细胞破碎后酶液与树脂载体结合，使脱氧核糖转移酶固定于树脂载体上，工艺简单，固定化酶可以长时间保持活力(连续使用30天以上，转化率保持在80％以上)，固定化树脂载体可以回收重复利用，成本低廉且易操作适合工业化。胸苷(dT)转化率：[dDA(mmol/L)/起始dT(mmol/L)]×100％反应效率高：利用该工艺生产2'-脱氧-2-氨基腺苷与文献报道相比，反应速度快且转化率高，底物胸苷转化率达到90％以上，底物胸苷浓度高达500mmol/L，操作简单，易工业化。2'-脱氧-2-氨基腺苷(dDA)收率：[dDA成品质量/dDA实际质量]×100％环保压力小：该工艺是利用固定化脱氧核苷转移酶为酶源，以纯化水为反应体系连续快速酶促合成2'-脱氧-2-氨基腺苷，既提高了酶的利用率，既降低成本，又大大减少了废液排放量。2)提取工序产物易提取、收率高：该工艺产物积累浓度最高达450mmol/L以上，固定化酶与反应液易分离，产物易提取，收率高(≥90％)。环保：该工艺使用碱乙醇和碱水为溶剂,提取工艺简单且成本低,溶剂可重复套用，实现了零排放，工艺环保且适合工业化。产品质量高：利用该工艺生产得到的目的产物2'-脱氧-2-氨基腺苷与其他工艺相比，由于反应体系为纯化水、合成液中各个组分非常明确，产物易提取，产品质量高，成品含量≥99.9％(市场销售一般为≥98％)。附图说明图1为
技术实现思路
中转化过程详细工艺流程图；图2为实施例1中1.1培养温度对菌体生长和酶活性的影响；图3为实施例1中1.2不同pH下培养20h的菌体浓度和酶活；图4为实施例1中1.3DUR201505001菌株发酵产酶曲线；图5为实施例1中2.1不同反应温度下底物转化率；图6为实施例1中2.2反应体系pH值对转化率的影响；图7为实施例1中2.3不同底物配比下胸苷转化率；图8为实施例1中2.4底物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.利用密西根克雷伯氏菌合成2'‑脱氧‑2‑氨基腺苷的方法，其特征在于：以胸苷和2,6‑二氨基嘌呤为原料，利用密西根克雷伯氏菌转化合成2'‑脱氧‑2‑氨基腺苷。

【技术特征摘要】
1.利用密西根克雷伯氏菌合成2'-脱氧-2-氨基腺苷的方法，其特征在于：以胸苷和2,6-二氨基嘌呤为原料，利用密西根克雷伯氏菌转化合成2'-脱氧-2-氨基腺苷。2.根据权利要求1所述合成2'-脱氧-2-氨基腺苷的方法，其特征在于：所述密西根克雷伯氏菌，其拉丁名为Klebsiellamichiganensis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.16111。3.根据权利要求1所述合成2'-脱氧-2-氨基腺苷的方法，其特征在于：转化合成过程包括：菌体制备、固定化酶制备、酶促反应和产品提取。4.根据权利要求3所述合成2'-脱氧-2-氨基腺苷的方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨西宁，李涛，邢善涛，王东琨，祁峰，靳海燕，张赛楠，
申请(专利权)人：新乡拓新药业股份有限公司，新乡制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：河南,41