一种AFF细胞制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种AFF细胞及其制备方法。所述AFF细胞的制备方法，包括以下主要步骤：1)抽取患者外周血，进行ctDNA外显子测序，或者以肿瘤组织进行全外显子测序，筛选出突变位点，进行抗原表位预测并合成突变多肽；2)使用外周血制备永生化DC，并负载所述突变多肽，与PBMC共孵育，获得AFF细胞。

An AFF cell

The invention belongs to the field of biotechnology, in particular to an AFF cell and a preparation method thereof. The preparation method of AFF cells includes the following main steps: 1) extracting peripheral blood of patients, sequencing the exon of ctDNA, or sequencing the whole exon of tumor tissue, screening mutation sites, predicting antigen epitopes and synthesizing mutated polypeptide; 2) preparing immortalized DC using peripheral blood, loading the mutated polypeptide, and co-incubating with PBMC to obtain AFF cells.

【技术实现步骤摘要】
一种AFF细胞
：本专利技术属于生物
，具体地说，涉及一种AFF细胞及其制备方法。
技术介绍
：目前，在肿瘤的特异性免疫治疗方面，现有的LAK、DC、CIK、DC-CIK细胞和方法基本被证明是无效的，而NK、CAR-NK、TIL、等细胞技术还有待成熟，CAR－T细胞在安全性和实体瘤治疗中还有缺陷。现有技术一般通过改造DC细胞，由DC递呈T细胞产生特异杀伤。有些实验室在尝试用病毒做为载体的方法进行转染递呈T细胞，诱导T细胞的特异性杀伤。我们也曾用突变混合多肽直接刺激PBMC，诱导T细胞。还有实验室利用TCR-T技术，靶向递呈MAGEA3抗原。以上治疗方法并不成熟，尤其是体外诱导DC细胞及DC细胞负载肿瘤抗原技术理论上研究较多，但在具体实施过程中还有许多问题，缺乏明确的、肿瘤细胞发生发展关键的信号传导通路相关分子作为诱导抗原，因为肿瘤抗原不明及肿瘤微环境免疫抑制的障碍，使实现特异性细胞靶向免疫治疗难以顺利实施。另外，有的虽然进行了抗原体外冲击，但没有进行体外共培育和体外扩增，让较为单薄的特异性细胞直接面对复杂的肿瘤微环境，因此，很难起到预期的效果。也有的虽然也可以体外递呈和共培育，但靶点单一(MAGE-3)，仅对非小细胞肺癌等个别癌种起效。虽然也有尝试慢病毒为载体的方法进行转染递呈，但安全性、方便性不如多肽方式。而简单混合多肽的直接刺激，虽然简单方便，但效率较低。特异性精准多肽的二次刺激不如T细胞受体转导的肿瘤特异性抗原更直接。现有的TCR-T在治疗血液肿瘤和实体肿瘤的解决方案中，缺乏覆盖更多瘤种的精准的TCR。上述方案均没有考虑T细胞的自我防护技术，使得数量不多的特异性T细胞直接面对强大的肿瘤微环境。
技术实现思路
：为了解决上述技术问题，本专利技术将提供一种AFF细胞，所述AFF细胞的制备方法，包括以下主要步骤：1)抽取患者外周血，进行ctDNA外显子测序，或者以肿瘤组织进行全外显子测序，筛选出突变位点，进行抗原表位预测并合成突变多肽；2)使用外周血制备永生化DC，并负载所述突变多肽，与PBMC共孵育，获得AFF细胞。AFF细胞具体制备步骤如下：1、全外显子测序使用人源外周血进行ctDNA测序或者以肿瘤组织进行全外显子测序，将测序结果与正常细胞的基因组相比，筛选出突变位点；所述外周血也可以是市售工程细胞系，如H1299、H226、H358、H1563、H2228、A549、Renca、LLC小鼠Lewis肺癌细胞、CRL-6323B16F1、CRL-25394T1、U14小鼠子宫颈癌细胞、BV-2小鼠小胶质瘤细胞、G422小鼠神经胶质瘤细胞等，对其进行全外显子测序；2、抗原表位预测(1)以突变的氨基酸位点为中心，向两侧延伸10个氨基酸，将这段21个氨基酸的多肽作为“潜在抗原表位”；(2)使用预测软件分析潜在抗原表位的IC50，将IC50＜1000nM的潜在抗原表位确定为“抗原表位”；3、永生化DC负载突变多肽(1)将外周血中的树突状细胞，采用TAX-GFP慢病毒进行感染，并选取理想的克隆作为永生DC；(2)将“抗原表位”合成突变多肽，对上述永生DC进行负载；4、负载突变多肽的DC与PBMC共孵育将负载突变多肽的DC与PBMC共孵育，即可获得AFF细胞。有益效果：1.本专利技术提供的AFF细胞，以肿瘤抗原为突变抗原，与其它组织不同，靶点专一性强，不易发生脱靶效应，安全性高；2.本专利技术获得的特异性细胞比例高，通常能够识别肿瘤抗原的特异性细胞，在PBMC的分布为0.5％以下，经过AFF方案改造的细胞，识别肿瘤抗原的特异性T细胞比例为20％以上。附图说明：图1显微镜观察DC形态；图2DC负载多肽的效率；图3AFF细胞分型检测；图4ELISA检测细胞因子IFN-γ的释放；图5流式检测识别多肽抗原的特异性T细胞比例；图6细胞杀伤效率检测；图7细胞对肿瘤荷瘤小鼠的生存改善情况。具体实施方式：下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。对于专用名词AFF的解释，其中，A：永生化DC技术；FF：混合多肽刺激技术。AFF细胞表示采用上述技术联合制备获得的细胞。实施例1本实施例将以肺癌患者为例，提供具有针对性的AFF细胞及其制备方法：1.全外显子测序1)取肺癌患者外周血，进行ctDNA的测序和HLA分型检测；2)利用软件对测序信息进行分析：将ctDNA测序结果与正常细胞的基因组相比，筛选出突变位点；2.抗原表位预测1)以突变的氨基酸位点为中心，向两侧延伸10个氨基酸，将这段21个氨基酸的多肽作为“潜在抗原表位”；2)使用预测软件分析潜在抗原表位的IC50(推荐软件：NetMHCpan3.0、PickPocket、artificialneuralnetworks(ANN))，如IC50＜1000nM则认为此潜在抗原表位为“抗原表位”；3.合成多肽委托技术服务公司将“抗原表位”合成突变多肽；4.永生化DC1)抽取患者外周血100ml；2)Ficol密度梯度离心分离PBMC；3)采用美天旎树突状细胞分离试剂盒分离树突状细胞，重悬于培养基中；4)TAX-GFP慢病毒感染所分离的树突状细胞，37℃孵箱静止培养，观察；5)待细胞克隆化生长后，挑选克隆于96孔板分别培养；6)单克隆表型分析；7)选取理想的克隆作为永生DC；5.永生DC负载突变多肽1)配制多肽溶液：采用步骤3合成的突变多肽进行配制，每条多肽的终浓度为10～100μg/mL，优选50μg/mL，备用；2)离心收集获得的永生DC，以配制的多肽溶液重悬，并置于细胞培养板中进行多肽负载；3)37℃5％CO2，冲击1～4h，优选4h，备用；6.负载突变多肽的DC与PBMC共孵育1)刺激因子OKM-25预铺板，40μLOKM-25+4mLPBS，2mL/皿(4.5cm2)室温4h，4℃备用；2)将负载突变多肽的DC与PBMC，以1：50～1：500的比例进行混合，优选1：100，并转移至预铺OMK25的细胞培养板或培养瓶中；3)晃匀，37℃5％CO2培养，记为第0天；4)观察共培养细胞情况，根据细胞密度，在第5天，将共培养细胞转移至大培养瓶中，补新鲜的培养液OKM-100+12％FBS，20mL于75cm2培养瓶中；5)共培养第7天，再加入20mL新鲜OKM-100+12％FBS；6)共培养第10天，培养液为OKM-200+5％FBS，将共培养细胞从75cm2瓶中那个转移至175cm2大瓶中；转移方法：25mL培养液OKM-200+5％FBS吹打，再转入大瓶，重复2次；以培养液OKM-200+5％FBS补足至200mL。8)培养至14-21天时，即可获得AFF方案细胞。7.构建肿瘤模型生存实验1)稳定过表达特异性抗原肽(6号多肽)的肿瘤细胞系接种NGS小鼠，做异位荷瘤动物模型；将5×105表达特异性抗原的肿瘤细胞悬于100μl生理盐水中，分别皮下注射至30只NSG小鼠的右侧胁肋部皮下，同时对小鼠进行编号；2)在肿瘤生长至100-120mm3左右时分组回输细胞，根据肿本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种AFF细胞，其特征在于，所述AFF细胞由以下步骤制备：1)抽取患者外周血，进行ctDNA外显子测序，或者以肿瘤组织进行全外显子测序，筛选出突变位点，进行抗原表位预测并合成突变多肽；2)使用外周血制备永生化DC，并负载所述突变多肽，与PBMC共孵育，获得AFF细胞。

【技术特征摘要】
1.一种AFF细胞，其特征在于，所述AFF细胞由以下步骤制备：1)抽取患者外周血，进行ctDNA外显子测序，或者以肿瘤组织进行全外显子测序，筛选出突变位点，进行抗原表位预测并合成突变多肽；2)使用外周血制备永生化DC，并负载所述突变多肽，与PBMC共孵育，获得AFF细胞。2.如权利要求1所述AFF细胞，其特征在于，所述患者外周血也可以是市售工程细胞系。3.如权利要求1所述AF...

【专利技术属性】
技术研发人员：焦顺昌，张嵘，周子珊，陈小彬，张天赋，王海燕，陈红利，
申请(专利权)人：北京鼎成肽源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11