一种非病毒转染试剂及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于基因工程领域,尤其涉及一种转染试剂及其制备方法和应用，所述转染试剂组成为：终浓度为10～50ng/ml的阳离子聚合物、终浓度为0.1～20μg/ml的重组多肽、终浓度为5～80ng/ml的阳离子脂质体。本发明专利技术能够显著提高具有单一溶酶体逃逸效应的非病毒载体的转染效率，进而提高核酸的递送效率；此外，本发明专利技术采用分子自组装方法，可以方便的大规模制备转染复合物，而且该复合物在生物体内可降解，具有较高的使用安全性。

A non-viral transfection reagent and its preparation method and Application

The invention belongs to the field of genetic engineering, in particular to a transfection reagent and its preparation method and application. The transfection reagent consists of cationic polymer with final concentration of 10-50 ng/ml, recombinant polypeptide with final concentration of 0.1-20 ug/ml and cationic liposome with final concentration of 5-80 ng/ml. The present invention can significantly improve the transfection efficiency of non-viral vectors with single lysosome escape effect, thereby improving the delivery efficiency of nucleic acid; moreover, the present invention adopts the method of molecular self-assembly, which can conveniently prepare transfection complex on a large scale, and the complex can be degraded in vivo, and has high safety in use.

【技术实现步骤摘要】
一种非病毒转染试剂及其制备方法和应用
本专利技术属于基因工程领域,尤其涉及一种非病毒转染试剂及其制备方法和应用。
技术介绍
细胞转染技术指将带有目的基因的外源DNA或RNA掺入宿主细胞而使细胞获得新遗传标志的方法。它是分析细胞内基因、基因产物、蛋白表达功能的重要分析工具。细胞转染的主要目的是通过增强或抑制细胞中特定基因的表达来研究基因、基因产物及重组蛋白的功能。细胞转染技术在基因工程领域具有巨大的应用价值，例如通过基因疗法将目的基因转染进细胞来治疗疾病或改善患者的症状，通过中国仓鼠卵巢细胞获得的人组织纤溶酶原激活物等。迄今研究开发的基因载体主要有病毒载体和非病毒载体两大类，目前最常用的非病毒性转染介质是脂质体和阳离子聚合物，它们的特点和病毒类似，容易透过细胞膜。病毒载体，如逆转录病毒、腺病毒、疱疹病毒、腺相关病毒等，虽然转染效率高，但存在着在人体内有自我复制的风险；而非病毒载体由于容易大规模制备、成本低、对外源基因无大小限制、具有低免疫原性和相对安全等优点，由于病毒介质的局限性，阳离子聚合物转染试剂日益受到重视。阳离子聚合物可作为一种非病毒载体,具有类细胞结构和生物膜的特性,在体内可降解同时可以保护其运载基因片段的生物活性,而且操作简单、重复性好，是一种有临床应用潜力的基因转染载体。阳离子聚合物(cationicpolymers)转染原理是带正电的聚合物与核酸带负电的磷酸基团形成带正电的复合物后与细胞表面带负电的蛋白多糖相互作用并通过内吞作用进入细胞。常用的阳离子聚合物有聚L-赖氨酸(PLL)、聚乙烯亚胺(PEI)、树状病毒包膜糖蛋白聚合物、壳聚糖等。但因为细胞毒性非常大，在体内转染过程中引起血细胞凝固等问题，现有的阳离子聚合物不能同时具备安全低毒和高效转染两个基本要求，因此，在很大程度上限制了其应用。病毒包膜糖蛋白B(EnvelopeglycoproteinB,gB)，可通过结合哺乳动物细胞表面广泛存在的受体上，例如通过哺乳动物各种细胞上的乙酰肝素粘多糖(heparinsulfateproglycan，HSPG)介导病毒入侵过程，而且gB糖蛋白可以在不依赖其他病毒囊膜蛋白的情况下独自发挥功能。同时gB与宿主细胞的结合也可以不依赖HSPG，同时gB还可结合到细胞整合素(integrin)或表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)从而促进病毒入侵过程。尽管病毒包膜糖蛋白肽本身可以快速和高效的进入细胞，但是其结合和装载siRNA或质粒DNA的能力有限，单独使用转染多肽无法高效运输siRNA或质粒DNA。
技术实现思路
有鉴于病毒转染的安全风险、阳离子聚合物的低效和对细胞毒副作用，本专利技术公开了一种非病毒转染试剂及其制备方法和应用，所述非病毒转染试剂可以提高转染效率，同时减少单用一种阳离子聚合物对细胞的毒副作用。本专利技术通过以下技术方案实现：一种非病毒转染试剂，包括：终浓度为10～50ng/ml的阳离子聚合物、终浓度为0.1～20μg/ml的重组多肽、终浓度为5～80ng/ml的阳离子脂质体。进一步的，所述非病毒转染试剂，包括：终浓度为20ng/ml的阳离子聚合物、终浓度为8μg/ml的重组多肽、终浓度为40ng/ml阳离子脂质体。进一步的，所述非病毒转染试剂的阳离子聚合物是基于质子海绵效应的一种或任意配比的多种阳离子聚合物。优选地，所述阳离子聚合物包括聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚酰胺基胺或壳聚糖等。进一步的，所述重组多肽为病毒包膜糖蛋白；所述病毒包膜糖蛋白为树状病毒包膜糖蛋白，优选为重组疱疹病毒包膜糖蛋白。优选地的，所述重组gB多肽的氨基酸序列为SEQIDNO:1或SEQIDNO：2所示。进一步的，所述阳离子脂质体为双十二烷基二甲基溴化铵DDAB、胺类阳离子类脂包括季铵、伯胺、仲胺等胺盐类脂质体，例如氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵DOTMA、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油烯氧基丙基铵DORIE、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油酰氧基丙基铵DORI等季铵盐脂质体。进一步的，所述转染试剂还包括溶剂；所述溶剂为HBS(pH7.4)。一种上述的非病毒转染的制备方法，包括以下步骤：阳离子聚合物、重组多肽、阳离子脂质体和溶剂混合，得到非病毒转染制剂。进一步的，所述非病毒转染试剂的制备方法，包括以下步骤：1)、配制阳离子聚合物溶液；2)、重组多肽的制备；阳离子脂质体/重组多肽复合物的制备；3)、转染试剂的制备。进一步的，所述步骤1)中阳离子聚合物溶液配制操作包括：(1)HBS(pH7.4)的配制：将NaCl溶解于超纯水，加入HEPES，调pH值，定容，过滤后储存于4℃备用；(2)将阳离子聚合物粉末溶解于步骤(1)配制的HBS(pH7.4)中，震荡均匀，配置成所需浓度的PEI溶液，过滤，储存于4℃备用。进一步的，所述步骤2)中阳离子脂质体/病毒包膜糖蛋白复合物的制备，包括：取等量阳离子脂质体和病毒包膜糖蛋白溶解于1×HBS(pH7.4)中，震荡均匀，过滤，即得到阳离子脂质体/病毒包膜糖蛋白复合物溶液，储存于4℃备用。一种利用上述非病毒转染试剂进行转染的方法，包括：(4)取一管，编号为1号管：无血清培养基中加入非病毒转染试剂和无血清培养基，室温5min；(5)另取一管，编号为2号管：加入核酸和Opti-MEM培养基；(6)将1号管溶液按每分钟1ml的速度缓慢加入2号管中，再涡旋混匀；静置，加入无血清培养基中；12-16h后换成完全营养培养基(例如含有10％血清DMEM培养基)；离心，过滤。进一步的，所述无血清培养基，包括Opti-MEM培养基、DMEM、α-MEM、EMEM,1640等基础培养基，进一步的，所述核酸为质粒DNA、基因片段、双链或单链DNA片段、cDNA中的一种或任意配比的多种的组合。本专利技术有益效果：本专利技术的转染多肽可作为细胞转染增强剂，辅助阳离子聚合物介导的细胞转染。与阳离子聚合物联合使用时，阳离子聚合物和多肽主要通过电荷作用结合在一起，这种结合是共价结合，不会破坏蛋白质的生物学活性。但是这种结合可以将蛋白质的酶切位点和结合位点掩盖，故无法被培养基中的酶所识别，从而能有效保护多肽而不受酶的降解，能够提高转染效率。本专利技术提供的包膜糖蛋白B多肽在与细胞膜作用时通过侵入或结合结构使DNA聚合物粘附在细胞上，提高基因转染效率，不会引起细胞毒性。本专利技术提供的病毒包膜糖蛋白B多肽没有病毒载体的感染潜力，因而没有病毒复制和感染的安全问题，具有应用于基因治疗的潜力。本专利技术能够显著提高具有单一溶酶体逃逸效应的非病毒载体的转染效率，进而提高核酸的递送效率；此外，本专利技术采用分子自组装方法，可以方便的大规模制备转染复合物，而且该复合物在生物体内可降解，具有较高的使用安全性。附图说明图1为阳离子PEI聚合物单独转染Hela细胞后GFP基因的表达情况；其中1(A)为：明场图；1(B)为：荧光图；1(C)为：叠加图。图2为脂质体单独转染Hela细胞后GFP基因的表达情况；其中2(A)为：明场图；2(B)为：荧光图；2(C)为：叠加图。图3为PEI和脂质体组合物转染Hela细胞后GFP基因的表达情况；其中3(A)为：明场图；3(B)为：荧光图；3(C)为：叠加图。图4为PEI和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种非病毒转染试剂，其特征在于，包括：终浓度为10～50ng/ml的阳离子聚合物、终浓度为0.1～20μg/ml的重组多肽和终浓度为5～80ng/ml的阳离子脂质体。

【技术特征摘要】
1.一种非病毒转染试剂，其特征在于，包括：终浓度为10～50ng/ml的阳离子聚合物、终浓度为0.1～20μg/ml的重组多肽和终浓度为5～80ng/ml的阳离子脂质体。2.根据权利要求1所述的非病毒转染试剂，其特征在于，所述非病毒转染试剂的阳离子聚合物是基于质子海绵效应的一种或至少两种阳离子聚合物。3.根据权利要求3所述的非病毒转染试剂，其特征在于，所述阳离子聚合物包括聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚酰胺基胺或壳聚糖。4.根据权利要求1所述的非病毒转染试剂，其特征在于，所述病毒包膜糖蛋白为树状病毒包膜糖蛋白。5.根据权利要求4所述的非病毒转染试剂，其特征在于，所述重组病毒包膜糖蛋白为重组gB多肽；所述重组gB多肽的氨基酸序列为SEQIDNO：1或SEQIDNO：2所示。6.根据权利要求1所述的非病毒转染试剂，其特征在于，所述阳离子脂质体为双十二烷基二甲基溴化铵DDAB或胺类阳离子类脂质体。7.一种权利要求1-6任意一项所述的非病毒转染试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)、配制阳离子聚合物溶液；2)、阳离子脂质体/病毒包膜糖蛋白复合物的制备；3)、转染试剂的制备。8.根据权利要求7所述的非病毒转染试剂的制备方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄新珠，江福能，张蓓，邹翠云，钟惟德，
申请(专利权)人：广州辉园苑医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44