一种决定柑橘柚植物自交不亲和性的基因及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种决定柑橘柚植物自交不亲和性的基因，包括两个等位基因，分别为CgRNS1和CgRNS2，CgRNS1的序列如SEQ ID NO:1所示，CgRNS2的序列如SEQ ID NO:3所示；还涉及上述基因在鉴定柑橘柚植物自交不亲和性中的应用；还涉及一种鉴定柑橘柚植株自交不亲和性的试剂盒及方法。本发明专利技术首次克隆了柑橘的2个自交不亲和花柱基因，提供了验证柑橘自交不亲和花柱基因的一种有效手段，根据杂交后代基因型的分离比即可确定候选基因是否参与自交不亲和反应。该方法耗时短，只需要采集杂交后代幼嫩叶片即可，方便快捷。

A Gene Determining Self-incompatibility of Citrus Pomelo Plants and Its Application

The present invention relates to a gene determining self-incompatibility of Citrus pomelo plants, including two alleles, CgRNS 1 and CgRNS2, CgRNS 1 sequence as SEQ ID NO:1, CgRNS2 sequence as SEQ ID NO:3, application of the above genes in identifying self-incompatibility of Citrus pomelo plants, and a reagent for identifying self-incompatibility of Citrus pomelo plants. Box and method. The invention clones two self-incompatible style genes of Citrus for the first time, provides an effective means to verify the style genes of citrus self-incompatibility, and determines whether candidate genes participate in the self-incompatibility reaction according to the segregation ratio of genotypes of hybrid offspring. This method is time-consuming, and only needs to collect young leaves of hybrid offspring, which is convenient and fast.

【技术实现步骤摘要】
一种决定柑橘柚植物自交不亲和性的基因及其应用
本专利技术涉及柑橘柚植物的分子生物学标记应用领域，更特别地，涉及一种决定柑橘柚植物自交不亲和性的基因，上述基因在鉴定柑橘柚植物自交不亲和性中的应用，以及一种鉴定柑橘柚植株自交不亲和性的试剂盒及方法。
技术介绍
自交不亲和性指植物的雌雄两性器官机能正常，但进行自花授粉或使用与花柱相同基因型的花粉授粉时，不能受精或结实的现象。自交不亲和在物种进化上具有重要作用，它促进异交，抑制自交，从而增加物种多样性。但另一方面，具有自交不亲和性状的物种，其栽培过程皆需要配置合适的授粉树，这对于生产过程则是一大弊端。柑橘作为世界第一大类水果之一，具有巨大的产业经济价值巨大。柑橘的栽培种主要包括人们熟知的柚类，橙类，桔类等。其中柑橘柚类(Citrusgrandis)具有广泛的自交不亲和现象，其中以传统的沙田柚为代表，其主要种植地区在广西桂林。由于沙田柚具有严重的自交不亲和现象，当地人们皆采用人工授粉的方式进行授粉，其工作量巨大，且耗时久。有研究显示，自交不亲和多数是由一个S位点的复等位基因控制。该位点有不同的S单体型，至少包含两个多态性基因，雌性决定因子和雄性决定因子。这两个基因都具有典型的组织特异性表达特点，即雌性因子只在花柱中表达，雄性因子只在花粉及花粉管中表达。
技术实现思路
我们在研究过程中发现柑橘柚类植物的自交不亲和基于S-RNase介导的配子体自交不亲和机制，通过一种由花柱基因编码的核糖核酸酶来决定其自交不亲和性，并鉴定了该基因的两个等位基因。基于以上研究，我们提供了一种决定柑橘柚植物自交不亲和性的基因，包括两个等位基因，分别为CgRNS1和CgRNS2，CgRNS1的序列如SEQIDNO:1所示，CgRNS2的序列如SEQIDNO:3所示。本专利技术首次克隆了柑橘的2个自交不亲和花柱基因(CgRNS1和CgRNS2)，这两个基因在花柱中特异表达，且具有典型的自交不亲和基因特征。高等电点，N端含有疏水信号肽区域。序列结构上，都只含有一个内含子，5个保守结构域，以及2个高变区。因此，根据保守结构域设计合适的简并引物，有望克隆出更多的柑橘S基因。这为柑橘自交不亲和的研究奠定了重要的基础。本专利技术还提供了上述基因在鉴定柑橘柚植物自交不亲和性中的应用。本专利技术还提供了一种鉴定柑橘柚植株自交不亲和性的试剂盒，包括CgRNS1的检测试剂和CgRNS2的检测试剂。在一个实施方案中，所述试剂盒为基于PCR的试剂盒。在一个优选实施方案中，CgRNS1的检测试剂中包括CgRNS1的检测引物对，序列如SEQIDNO:5和6所示。在一个优选实施方案中，CgRNS2的检测试剂中包括CgRNS2的检测引物对，序列如SEQIDNO:7和8所示。本专利技术还提供了一种鉴定柑橘柚植株自交不亲和性的方法，包括鉴定所述柑橘柚植株中决定自交不亲和性的基因的步骤。在一个优选实施方案，所述方法包括以下步骤：步骤1：从所述柑橘柚植株上采集带有全套遗传物质的组织；步骤2：从所述组织中提取基因组作为模板，使用CgRNS1的检测引物对和CgRNS2的检测引物对分别进行扩增；步骤3：根据扩增产物的结果判定所述柑橘柚植株是否可接受基因型为CgRNS1或CgRNS2的雄配子，当扩增结果显示CgRNS1阳性时，则不能接受基因型为CgRNS1的雄配子，当扩增结果显示CgRNS2阳性时，则不能接受基因型CgRNS2的雄配子。在一个优选实施方案中，步骤1中所述带有全套遗传物质的组织为叶片组织。在一个优选实施方案中，步骤2中，CgRNS1的检测引物对序列如SEQIDNO:5和6所示，CgRNS2的检测引物对序列如SEQIDNO:7和8所示。本专利技术提供了验证柑橘自交不亲和花柱基因的一种有效手段，根据杂交后代基因型的分离比即可确定候选基因是否参与自交不亲和反应。该方法耗时短，只需要采集杂交后代幼嫩叶片即可，方便快捷。本专利技术构建的3个柚类杂交群体后代，有利于自交不亲和基因型的分离以及鉴定。本专利技术基于CgRNS1和CgRNS2序列设计了特异性扩增引物，该引物可稳定的检测CgRNS1和CgRNS2在物种中的纯在与否，这为柚类S基因型的鉴定提供了坚实的基础。附图说明图1为CgRNS1与CgRNS2基因的内含子/外显子结构图；图2为CgRNS1与CgRNS2基因序列比对图。实心圆表示保守的半胱氨酸，实心三角形表示保守的组氨酸。直线区域表示信号肽序列；图3为CgRNS1和CgRNS2在沙田柚的7种组织中的荧光定量表达统计图；图4为9个沙田柚(ST)×酸柚(SU)杂交群体后代，以及42个沙田柚(ST)×HB柚(HB)杂交群体后代CgRNS1和CgRNS2PCR扩增片段电泳照片；图5为118个HB柚(HB)×沙田柚(ST)杂交群体后代CgRNS1和CgRNS2PCR扩增片段电泳照片；图6为沙田柚与HB柚正交反交后子代基因型分离示意图。具体实施方式以下结合附图对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。1.沙田柚花粉以及花柱差异表达谱构建采取广西桂林沙田柚的叶片以及开花前一天的6个不同花器官组织材料(包括花药，花丝，花柱，子房，花柄，以及花瓣)。用液氮速冻，-80℃保存待用。所有组织材料的RNA参照Liu等人(LiuY,LiuQ.EfficientisolationofRNAfromfruitpeelandpulpofripeningnavelorange(CitrussinensisOsbeck)[D].JournalofHuazhongAgriculturalUniversity.2006)的方法进行提取，并将提取质量合格的花柱以及花粉RNA送入深圳华大公司进行建库测序，每个样品3个生物学重复。以本课题组构建的沙田柚10G的转录组数据作为参考序列(LiangM.,YangX,LiH,SuS,YiH,ChaiL,DengX.Denovotranscriptomeassemblyofpummeloandmolecularmarkerdevelopment[J].PlosOne,2015(10),e0120615)，对测序得到的cleardata进行比对，最终获得花柱中3241个基因相对于花粉下调，3456个基因上调。在这3456个花柱上调基因中存在2个被注释为核糖核酸酶基因，CL6572.Contig1_Cg和Unigene25359_Cg。因为这是柚类中首次鉴定到的核糖核酸酶基因，因此将其命名为CgRNS1(C.grandisRibonuclease1)和CgRNS2(C.grandisRibonuclease2)。2.CgRNS1和CgRNS2的序列分析及空间结构分析根据转录组获得的序列信息设计全长扩增引物，分别以沙田柚叶片DNA以及花柱cDNA为模板进行扩增。扩增引物分别为：CgRNS1-F：5’--ATGAACATTACTTTCTTCCTCTA--3’(SEQIDNO:9)CgRNS1-R：5’--TTAAGGCGGGGGAAAGGTA--3’(SEQIDNO:10)CgRNS2-F：5’--ATGAAGGCGACTAACCTCTTTC--3’(SEQIDNO:11)CgRNS2-R：5’--CTACTCATCGG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种决定柑橘柚植物自交不亲和性的基因，其特征在于，包括两个等位基因，分别为CgRNS1和CgRNS2，CgRNS1的序列如SEQ ID NO:1所示，CgRNS2的序列如SEQ ID NO:3所示。

【技术特征摘要】
1.一种决定柑橘柚植物自交不亲和性的基因，其特征在于，包括两个等位基因，分别为CgRNS1和CgRNS2，CgRNS1的序列如SEQIDNO:1所示，CgRNS2的序列如SEQIDNO:3所示。2.权利要求1所述的基因在鉴定柑橘柚植物自交不亲和性中的应用。3.一种鉴定柑橘柚植株自交不亲和性的试剂盒，其特征在于，包括CgRNS1的检测试剂和CgRNS2的检测试剂。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为基于PCR的试剂盒。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，CgRNS1的检测试剂中包括CgRNS1的检测引物对，序列如SEQIDNO:5和6所示。6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，CgRNS2的检测试剂中包括CgRNS2的检测引物对，序列如SEQIDNO:7和8所示。7.一种鉴定柑橘柚植株自交不亲和性的方法，其特征在于，包括鉴定所述柑...

【专利技术属性】
技术研发人员：柴利军，梁梅，曹宗洪，邓秀新，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42