水稻基因OsGDSL1及其抗稻瘟病的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种水稻基因OsGDSL1及其抗稻瘟病的应用，该基因的开放阅读框长1119bp，编码一种类GDSL脂肪酶，由372个氨基酸组成。本发明专利技术通过构建水稻过表达载体pCXUN‑HA‑OsGDSL1，借助农杆菌介导水稻成熟胚转化技术获得OsGDSL1过表达水稻植株，通过对野生型和过表达OsGDSL1水稻植株进行稻瘟病菌接种实验，结果显示过表达OsGDSL1提高了水稻植株对稻瘟病菌的抗性，表明该基因可用于培育抗稻瘟水稻品种。

Rice Gene OsGDSL1 and Its Application in Resistance to Rice Blast

The invention provides a rice gene OsGDSL1 and its application in rice blast resistance. The open reading frame of the gene is 1119 BP long and encodes a GDSL-like lipase, which consists of 372 amino acids. The invention constructs rice overexpression vector pCXUN HA OsGDSL1, obtains rice plants overexpressing OsGDSL1 by means of Agrobacterium-mediated mature embryo transformation technology, and carries out inoculation experiments on wild type and overexpressing OsGDSL1 rice plants. The results show that overexpressing OsGDSL1 improves rice plants'resistance to blast fungi. Resistance indicated that the gene could be used to breed blast-resistant rice varieties.

【技术实现步骤摘要】
水稻基因OsGDSL1及其抗稻瘟病的应用
本专利技术属于水稻培育领域，具体涉及一种水稻OsGDSL1基因及其过表达载体在水稻抗稻瘟病中的应用。
技术介绍
水稻是重要的经济作物之一，世界一半以上的人口都以水稻为主食，在粮食生产中占有及其重要的地位，稻瘟病菌引起的稻瘟病是影响水稻高质高产的主要病害。该病害具有爆发性强的特点，可导致水稻减产，甚至绝收的灾难性后果。当前，随着人们发现稻瘟病菌可侵染小麦、大麦、玉米等禾本科作物，该病害吸引了科学界更多的关注。一直以来，许多科学家致力于寻找有效防控稻瘟病的方法，以缓解粮食短缺和安全可能带来的问题。实践证明，培育与种植抗病水稻品种是目前最经济、最有效的、最绿色环保的防治稻瘟病的措施。脂肪酶（Lipase）是一类可降解脂肪的羧基酯水解酶，将甘油三酯水解生成甘油和脂肪酸。大多数的脂肪酶都含有信号肽，都以丝氨酸残基（Ser）为活动中心，根据活性中心保守序列，脂肪酶可分为两类，即GxSxG的脂肪酶，和GDSL脂肪酶。在GxSxG脂肪酶中，Ser常出现在活性中心和催化位点；而在GDSL脂肪酶中Ser一般出现在靠近N端的区域。GDSL脂肪酶是脂肪酶家族中的一个新亚家族。该家族酶活性位点位置非常灵活，活性位点与底物结合从而改变了酶的构象，因此，该类酶具有广泛的底物结合性，并且功能也呈现出多样性。基因的位置影响其功能，该家族基因的分布呈现基因簇形式，例如脂肪酶家族OsGILP基因在水稻12条染色体上的均有分布，并且大多数基因分布在端粒末端着丝粒附近。脂肪酶广泛的存在于植物、动物、微生物中，并在植物组织器官，例如根、茎、叶、花、果实、种子均有积累。其种类繁多，功能各异。虽然该家族基因的研究起步较晚，相关功能研究报道较少，但是相关研究表明该家族基因参与代谢油脂，调控植物生长发育，以及抗逆反应。GDSL脂肪酶还参与了植物生长发育过程，拟南芥中脂肪酶RGE1调控种子萌发时胚胎的发育。此外，柱头上也存在另一种GDSL脂肪酶EXL4，该蛋白是花粉壁蛋白，可调控水化作用，促进花粉管的形成，有利于精子和胚珠的结合。番茄脂肪酶GDSL1是控制果皮角质沉淀的关键蛋白，可决定果实表皮的厚度，还影响了果实对外界环境的适应能力。油菜GDSL脂肪酶基因BnLIP1不仅能参与油脂代谢，还可能与开花，荚果发育有关。植物GDSL脂肪酶在非生物胁迫下能够行使其功能。辣椒GDSL脂肪酶GDSL-lipase1(CaGL1)受茉莉酸甲酯(Me-JA)和人为造伤快速上调表达，但对水杨酸（SA）、乙烯（ET）或是烟草花叶病毒处理不敏感。水稻基因组至少编码了113个GDSL脂肪酶(OsGLIPs）。水稻GDSL脂肪酶数量之庞大得益于大规模的基因串联重复事件。该家族基因呈现组织专一表达，其中38个OsGLIPs基因在花柱头、萌发阶段的种子特异表达，其余部分基因仅在根部表达。此外，OsGLIPs基因受多种非生物胁迫诱导，例如干旱、盐、冷热胁迫。OsGLIPs还响应生物胁迫，据报道OsGLIP1和OsGLIP2负调控水稻免疫反应。植物激素SA或病原菌侵染抑制了这两个基因的转录表达。过表达OsGLIP1或OsGLIP2均降低了水稻对细菌、真菌的抵抗能力，反之亦然。目前，并没有关于水稻OsGDSL1基因在水稻抗稻瘟病应用的报道。采用生物技术手段改变水稻OsGDSL1的表达水平，提高水稻抗病能力，在实际应用中具有显著价值。因此，可以通过该基因的过量表达进行作物遗传改良，培育出抗稻瘟病的转基因水稻。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种水稻OsGDSL1基因在水稻抗稻瘟病中的应用，可以通过该基因的过量表达进行作物遗传改良，培育出抗稻瘟病的转基因水稻。为实现上述目的，采用以下技术方案：一种水稻OsGDSL1基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。所述水稻基因OsGDSL1其编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。含有水稻OsGDSL1基因的过表达载体，所示载体含有35S强启动子。水稻OsGDSL1基因或其构建的过表达载体在水稻抗稻瘟病中的应用。将所述过表达载体采用冷激法转化到根癌农杆菌EHA105中，借助农杆菌介导的水稻成熟胚转化技术获得OsGDSL1过表达水稻植株，对其进行喷雾接种稻瘟病抗性鉴定。抗性鉴定结果表明，过表达OsGDSL1基因使得水稻对稻瘟病的抗性明显增强。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术的水稻OsGDSL1基因在水稻中过表达与野生型水稻相比显著提高了抗稻瘟的能力，该基因可用于培育抗稻瘟水稻品种。附图说明图1pCXUN-HA载体图。图2pCXUN-HA-OsGDSL1过表达水稻的验证。图3通过qRT-PCR分析基因OsGDSL1在OsGDSL1过表达植株中的表达量。图4OsGDSL1转基因水稻对稻瘟病抗性测定结果。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明。实施例本专利技术通过构建OsGDSL1的过表达载体pCXUN-HA-OsGDSL1，再通过农杆菌介导的遗传转化方法将过表达载体pCXUN-HA-OsGDSL1转入水稻成熟胚中，所转化的水稻的背景品种为野生型水稻日本晴，从后代中筛选获得OsGDSL1过表达的株系，通过接种稻瘟病菌测定水稻抗病能力。具体包括如下步骤：OsGDSL1基因的获得及过表达载体pCXUN-HA-OsGDSL1的构建：从水稻基因组数据库中搜索获得OsGDSL1编码序列，以OsGDSL1的全长编码序列为模板进行引物设计，获得正向引物OsGDSL1-HA-F：5’-ATGAGGCTCTCGGTCTCCGTCG-3’与反向引物OsGDSL1-HA-R：5’-TCAGTGGTGGCGGGTCTCGAG-3’，以野生型水稻日本晴（NPB）cDNA为模板，用KODplus高保真酶扩增获得OsGDSL1，切胶回收后，用rTaq聚合酶加A尾。用XcmI酶将pCXUN-HA载体线性化，去除ccdB基因片段。将A尾产物与线性化pCXUN-HA连接，转化大肠杆菌感受态细胞。涂布LB平板（含有50mg/LKan）培养，37℃倒置培养18h，形成单菌落，利用菌落PCR筛选出阳性克隆，测序正确后菌液加入终浓度为15%的甘油混匀后于-80℃冰箱保存。获得pCXUN-HA-OsGDSL1的农杆菌菌株具体步骤：利用冷激法将重组载体pCXUN-HA-OsGDSL1的阳性克隆质粒转化入根癌农杆菌EHA105感受态细胞中，涂布LB平板（含有50mg/LKan、50mg/LRif）培养，28℃倒置培养2d，形成单菌落，利用菌落PCR筛选出携带目的基因的农杆菌。侵染水稻获得OsGDSL1过表达株系及验证：将含有pCXUN-HA-OsGDSL1重组载体的农杆菌转入水稻愈伤组织，通过筛选、分化、生根后得到阳性的过表达植株，并通过PCR扩增潮霉素抗性基因(HPH）片段鉴定植株的真实性，结果如图2所示，所选的植株均携带了潮霉抗性标签。提取水稻叶片RNA，反转录成cDNA，检测转基因水稻中OsGDSL1基因的基底表达，结果如图3显示，相比野生水稻，供试转基因水稻植株中OsGDSL1均上调表达，表达量上升了10-100倍，这说明OsGDSL1得到了过表达。过表达植株的抗病性测定：水稻NPB以及OsGDSL1过表达转基因水稻培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一个水稻基因OsGDSL1，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一个水稻基因OsGDSL1，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.如权利要求1所述水稻基因OsGDSL1其编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3....

【专利技术属性】
技术研发人员：鲁国东，宋林林，韩艺娟，林娅红，王宗华，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建,35