PacBio测序平台多样品混合测序文库构建的带标签接头及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种PacBio测序平台多样品混合测序文库构建的带标签接头及应用，所述带标签接头包括5’端连接的16个碱基序列、3’端连接的16个碱基序列和PacBio测序平台通用的哑铃结构平末端接头，5’端连接的16个碱基序列与3’端连接的16个碱基序列反向互补配对，带标签接头的碱基序列如SEQ ID No.1‑96所示。将该标签序列应用于混样测序，与现有技术相比，该标签序列的设计综合考虑每个标签之间的差异度、每个标签与通用接头之间的差异度，显著提高了标签序列识别效率和测序准确度，大幅度提高待测样本容量。同时，标签序列应用于混样测序，实现了同一个Cell中多个样本混合测序的流程，减少样本用量的同时也优化试剂用量，有效的节约了试剂耗材，降低了实验成本。

Tagged Joint and Its Application in the Construction of Mixed Sequencing Library of PacBio Sequencing Platform

The invention relates to a tagged joint constructed by a PacBio sequencing platform multi-product mixed sequencing library and its application. The tagged joint comprises 16 base sequences connected at 5'end, 16 base sequences connected at 3' end and a dumbbell structure flat-end joint commonly used in PacBio sequencing platform, 16 base sequences connected at 5'end and 16 base sequences connected at 3' end are inversely complementary pairs. The base sequence of labeled joints is shown in SEQ ID No.1 96. Compared with the existing technology, the design of the tag sequence takes into account the difference between each tag and the difference between each tag and the common connector, which significantly improves the efficiency of tag sequence recognition and the accuracy of sequencing, and greatly enhances the sample size to be tested. At the same time, tag sequence is applied to mixed sample sequencing, which realizes the process of multi-sample mixed sequencing in the same Cell, reduces the amount of samples and optimizes the amount of reagents at the same time, effectively saves the reagent consumption and reduces the experimental cost.

【技术实现步骤摘要】
PacBio测序平台多样品混合测序文库构建的带标签接头及应用
本专利技术涉及分子生物学领域，更具体地，涉及一种PacBio测序平台多样品混合测序文库构建的带标签接头及应用。
技术介绍
PacBio平台(PacBio核酸测序平台)采用的是单分子实时测序(SingleMoleculeReal-Time)。PacBio平台的测序基于两个关键技术，第一，PacificBiosciences公司专利技术的一种直径只有几十纳米的纳米孔，该纳米孔内只能容许单分子核酸在DNA聚合酶作用下进行反应，检测纳米孔中合成过程的A、T、C、G这四种荧光标记的脱氧核苷酸，即可实现核酸测序；第二，利用共聚焦显微镜实时、快速地对集成在SMRTcell上的无数的纳米孔同时进行记录。PacBio核酸测序平台，其平均读长可达10-15k，且测序不受AT和CG含量的影响，能够对高GC含量或低GC含量的区域进行测序，相比二代测序有较大优势目前常规的PacBio基因组建库测序流程是通过一个样品一个文库，至少测序1个Cell的方案来设计的，混样测序时，测序数据并不能进行有效的区分。在二代基因组测序技术中，混样建库测序流程已经非常成熟，方法也有很多，但由于PacBio的基因组文库构建没有PCR扩增这一步，无法通过PCR引入标签序列，只能通过将标签序列添加到接头上的方法进行混样测序。同时，由于基因组片段过大，如果文库过大，会导致barcode的识别效率非常低，从而影响测序数据的拆分比例。
技术实现思路
针对现有技术中存在的技术问题，本专利技术提出了一种PacBio测序平台多样品混合测序文库构建的带标签接头及应用，针对通用接头序列设计特异性的标签序列并将带标签的接头应用于混样测序，有效降低测序成本，提高测序准确度，并可大幅度提高待测样本容量。为实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术的第一个目的在于提出一种PacBio测序平台多样品混合测序文库构建的带标签接头，所述带标签接头包括5’端连接的16个碱基序列、3’端连接的16个碱基序列和PacBio测序平台通用的哑铃结构平末端接头，所述5’端连接的16个碱基序列与3’端连接的16个碱基序列反向互补配对；所述带标签接头的碱基序列如SEQIDNo.1-96所示。本专利技术的第二个目的在于提出一种适用于PacBio测序平台的多样品混合测序文库构建方法，包括如下步骤：(1)将打断后并已进行DNA损伤修复和末端修复的DNA样本作为起始样本；(2)针对每一个样本，选择带标签接头作为该样本接头；所述带标签接头包括5’端连接的16个碱基序列、3’端连接的16个碱基序列和PacBio测序平台通用的哑铃结构平末端接头，所述5’端连接的16个碱基序列与3’端连接的16个碱基序列反向互补配对；所述带标签接头的碱基序列如SEQIDNo.1-96所示；每个样本对应的标签接头均不相同；(3)纯化起始样本，分别对各个纯化起始样本及其对应的带标签接头进行连接反应；(4)分别对获得的连接产物进行外切酶消化和纯化，将纯化后的所有样本等量混合得到适用于PacBio测序平台的多样品混合测序文库。进一步地，所述步骤(3)连接反应体系为：纯化起始样本15.5μL、20μM带标签接头1μL、10X模板预制缓冲液2μL、10mMATPLow1μL、30U/μL连接酶0.5μL。进一步地，所述步骤(3)连接反应条件为：充分混匀，瞬时离心，25℃孵育15min，65℃孵育10min使连接酶失活。进一步地，所述步骤(4)中采用的外切酶为ExoIII和ExoVII外切酶。更进一步地，所述步骤(4)外切酶消化反应体系为：连接反应产物20μL、100U/μL外切酶III0.5μL、10U/μL外切酶VII0.5μL。进一步地，所述步骤(4)中采用0.45X的AMPurePB磁珠进行两次纯化，以去除小片段文库。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：(1)本专利技术的PacBio测序平台多样品混合测序文库构建的带标签接头，针对通用接头序列设计含16对反向互补碱基的特异性的标签序列，并将该标签序列应用于混样测序，与现有技术相比，该标签序列的设计综合考虑每个标签之间的差异度、每个标签与通用接头之间的差异度，显著提高了标签序列识别效率和测序准确度，并可大幅度提高待测样本容量。(2)同时，本专利技术的标签序列应用于混样测序，实现了在同一个Cell中进行多个样本混合测序的流程，减少样本用量的同时也优化试剂用量，有效的节约了试剂耗材，降低了实验成本。在测序结果出现偏差时，还可以通过调整混样文库比例的方法进行加测。附图说明图1为本专利技术的适用于PacBio测序平台的多样品混合测序文库构建流程图。图2为本专利技术的带标签接头的结构示意图。具体实施方式展示一下实例来具体说明本专利技术的某些实施例，且不应解释为限制本专利技术的范围。对本专利技术公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本专利技术的的精神和范围之内。本专利技术提供的适用于PacBio测序平台的多样品混合测序文库构建方法中所用试剂均可由市场购得；其中，AMPurePB磁珠、DNA损伤修复缓冲液、NAD+、ATPHi、dNTP、DNA损伤修复酶预混液、末端修复酶预混液、模板预制缓冲液、ATPLow、连接酶、外切酶III、外切酶VII购自PacBio公司，无核酸酶水购自NEB公司。本专利技术针对现有的利用PacBio测序平台混样测序存在的标签识别率低、测序准确度不高等技术问题，针对通用接头序列设计含16对互补碱基的特异性的标签序列，并将该标签序列应用于混样测序。该标签序列的设计综合考虑每个标签之间的差异度、每个标签与通用接头之间的差异度，显著提高了标签序列识别效率和测序准确度，并可大幅度提高待测样本容量。本专利技术的适用于PacBio测序平台多样品混合测序文库构建的带标签接头的具体结构如图1所示，图中N表示A、T、C、G，包括5’端连接的16个碱基序列、3’端连接的16个碱基序列和PacBio测序平台通用的哑铃结构平末端接头，5’端连接的16个碱基序列与3’端连接的16个碱基序列反向互补配对，带标签接头的碱基序列如SEQIDNo.1-96所示。标签序列用于识别不同的样本，对某一固定标签序列，其序列是固定的。设计好的引物在引物合成公司如上海生工等公司进行合成。将上述的带标签接头应用于PacBio测序平台的多样品混合测序文库构建，具体方法如图2所示：(1)将打断后并已进行DNA损伤修复和末端修复的DNA样本作为起始样本。(2)针对每一个样本，选择带标签接头作为该样本接头；所述带标签接头包括5’端连接的16个碱基序列、3’端连接的16个碱基序列和PacBio测序平台通用的哑铃结构平末端接头，所述5’端连接的16个碱基序列与3’端连接的16个碱基序列反向互补配对；所述带标签接头的碱基序列如SEQIDNo.1-96所示；每个样本对应的标签接头均不相同。(3)纯化起始样本，分别对各个纯化起始样本及其对应的带标签接头进行连接反应。其中连接反应体系为：纯化起始样本15.5μL、20μM带标签接头1μL、10X模板预制缓冲液2μL、10mMATPLow1μL、30U/μL连接酶0.5μL。连接反应条件为：充分混匀，瞬时离心，25℃孵育15min，65℃孵本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种PacBio测序平台多样品混合测序文库构建的带标签接头，其特征在于，所述带标签接头包括5’端连接的16个碱基序列、3’端连接的16个碱基序列和PacBio测序平台通用的哑铃结构平末端接头，所述5’端连接的16个碱基序列与3’端连接的16个碱基序列反向互补配对；所述带标签接头的碱基序列如SEQ ID No.1‑96所示。

【技术特征摘要】
1.一种PacBio测序平台多样品混合测序文库构建的带标签接头，其特征在于，所述带标签接头包括5’端连接的16个碱基序列、3’端连接的16个碱基序列和PacBio测序平台通用的哑铃结构平末端接头，所述5’端连接的16个碱基序列与3’端连接的16个碱基序列反向互补配对；所述带标签接头的碱基序列如SEQIDNo.1-96所示。2.一种适用于PacBio测序平台的多样品混合测序文库构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将打断后并已进行DNA损伤修复和末端修复的DNA样本作为起始样本；(2)针对每一个样本，选择带标签接头作为该样本接头；所述带标签接头包括5’端连接的16个碱基序列、3’端连接的16个碱基序列和PacBio测序平台通用的哑铃结构平末端接头，所述5’端连接的16个碱基序列与3’端连接的16个碱基序列反向互补配对；所述带标签接头的碱基序列如SEQIDNo.1-96所示；每个样本对应的标签接头均不相同；(3)纯化起始样本，分别对各个纯化起始样本及其对应的带标签接头进行连接反应；(4)分别对获得的连接产物进行外切酶消化和纯化，将纯化后的所有样本等量混合得到适用于PacBio测序平台的多样品混合测序文库。3.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：方涛，
申请(专利权)人：武汉菲沙基因信息有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42