一种人工合成的MAR共有序列、表达载体、表达系统及其应用技术方案

本发明专利技术涉及一种人工合成的MAR共有序列、表达载体、表达系统及其应用，属于生物技术领域。本发明专利技术的人工合成的MAR共有序列，由Humanβ‑globin MAR、Human MAR X‑29、Human MAR 1‑68、Human TOP1 MAR、Human HPRT MAR、Human MAR‑7、CHO MAR‑6、Human CSP‑B MAR、CHO DHFR intron MAR、Chicken lysozyme MAR、Human MAR‑2、Humanβ‑interferon MAR、Human MAR‑3中的至少两种的基序连接而成。本发明专利技术提供的人工合成的MAR共有序列的串联MAR序列可以提高CHO细胞中外源蛋白的表达量，能实现重组蛋白在宿主细胞中的高效表达。

【技术实现步骤摘要】
一种人工合成的MAR共有序列、表达载体、表达系统及其应用
本专利技术涉及一种人工合成的MAR共有序列、表达载体、表达系统及其应用，属于生物

技术介绍
随着基因工程技术的发展，利用基因工程生产的重组蛋白质的数量和种类不断的增加，并已经成为医药工业的重要部分。哺乳动物细胞由于具备类似于人类细胞的翻译后加工修饰(post-translationalmodifications，PTMs)的功能，因此，哺乳动物细胞表达系统是目前药物重组蛋白生产的重要平台。中国仓鼠卵巢(Chinesehamsterovary，CHO)细胞表达系统是目前应用最为广泛的一类动物细胞表达系统，其中近70％的药物蛋白(如抗体)是采用CHO细胞生产的。但是CHO细胞表达系统也存在重组蛋白表达水平低、高产稳定细胞筛选周期长、细胞培养成本高等缺陷，这严重制约着重组蛋白药物的生产。影响重组蛋白在CHO细胞中表达的因素众多，表达载体就是其中一个重要因素。此外，在CHO细胞表达系统中，高水平持续稳定表达的细胞株往往难以得到，这是因为转基因转染细胞后的随机整合，使有些转基因发生沉默或者表达水平降低，因此需要从大量细胞克隆株中分离出稳定高效表达的克隆细胞株，这也给基因工程产业化生产带来了很大困扰。核基质结合区序列(matrixattachmentregion，MAR)是限制酶消化后仍附着在核基质上的DNA序列。研究表明，MAR序列能提高CHO表达系统中转基因表达水平，同时降低转化株转基因表达水平差异。然而，目前为止，虽有关于MAR提高转基因表达的报道，申请公布号为CN106520832A的中国专利技术专利申请公开了一种双顺反子表达载体、表达系统、制备方法及应用；申请公布号为CN104975009A的中国专利技术专利申请公开了一种新型的含MAR核心片段的动物细胞表达载体。但两项公开的中国专利技术专利申请中MAR序列来源于天然的MAR序列，缺乏对有功能MAR序列的特征和共有序列分析，一方面导致常用的MAR元件较大，增加了载体构建的难度，另外质粒的转染效率会随着载体大小的增加而降低，从而限制了MAR元件在哺乳动物细胞表达系统中的应用。此外，由于缺乏对有功能MAR序列的分析，导致MAR元件中没有功能或者有副作用的元件存在，导致MAR的功能减弱或者增强作用被抵消。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种人工合成的MAR共有序列。该共有序列可增强哺乳动物表达系统转基因的表达，实现重组蛋白在宿主细胞的高表达。本专利技术还提供上述人工合成的MAR共有序列在提高哺乳动物表达系统中重组蛋白表达水平方面的应用。另外，本专利技术提供含上述人工合成的MAR共有序列的表达载体。本专利技术还提供上述表达载体在表达重组蛋白方面的应用。本专利技术还提供含上述表达载体的表达系统。最后，本专利技术提供上述表达系统在表达重组蛋白方面的应用。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种人工合成的MAR共有序列，所述人工合成的MAR共有序列由Humanβ-globinMAR、HumanMARX-29、HumanMAR1-68、HumanTOP1MAR、HumanHPRTMAR、HumanMAR-7、CHOMAR-6、HumanCSP-BMAR、CHODHFRintronMAR、ChickenlysozymeMAR、HumanMAR-2、Humanβ-interferonMAR、HumanMAR-3中的至少两种的基序连接而成。具体的，上述人工合成的MAR共有序列由如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7所示的序列连接而成，或由如SEQIDNO.8、SEQIDNO.9、SEQIDNO.10、SEQIDNO.11、SEQIDNO.12、SEQIDNO.13、SEQIDNO.14、SEQIDNO.15、SEQIDNO.16、SEQIDNO.17所示的序列连接而成，或由如SEQIDNO.18、SEQIDNO.19、SEQIDNO.20、SEQIDNO.21、SEQIDNO.22所示的序列连接而成，或由SEQIDNO.1-SEQIDNO.22所示的序列依次连接而成。所述SEQIDNO.1-SEQIDNO.22具体为SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.8、SEQIDNO.9、SEQIDNO.10、SEQIDNO.11、SEQIDNO.12、SEQIDNO.13、SEQIDNO.14、SEQIDNO.15、SEQIDNO.16、SEQIDNO.17、SEQIDNO.18、SEQIDNO.19、SEQIDNO.20、SEQIDNO.21、SEQIDNO.22。本申请的MAR共有序列是在分析Humanβ-globinMAR(GenBankaccessionno.L22754)、HumanMARX-29(GenBankaccessionno.EF694970.1)、Humanβ-interferonMAR(GenBankaccessionno.L22754)、HumanMAR1-68(GenBankaccessionno.EF694965.1)、HumanTOP1MAR(GenBankaccessionno.L23999.1)、HumanCSP-BMAR(GenBankaccessionno.M62716)、CHODHFRintronMAR(GenBankaccessionno.X06654)、HumanHPRTMAR(GenBankaccessionno.X07690)、ChickenlysozymeMAR(GenBankaccessionno.X98408)、HumanMAR-2(GenBankaccessionno.AC117476.6，60046-60836)、HumanMAR-6(GenBankaccessionno.NW_003613799.1，724006-725949)、HumanMAR-7(GenBankaccessionno.X67858.1)、HumanMAR-3(GenBankaccessionno.AC061708.17，61464-62030)的基础上，采用生物信息学设计合成了一种新型的MAR元件共有序列，与天然MAR序列相比，本申请的人工合成的MAR共有序列在提高CHO细胞转基因表达水平上效果更为显著。上述人工合成的MAR共有序列还包括转录因子结合位点的DNA片段。该片段可以提高转基因的表达及转染效率。上述人工合成的MAR共有序列在提高哺乳动物细胞表达系统中重组蛋白表达水平方面的应用。具体应用方法为：将上述人工合成的MAR共有序列插入哺乳动物细胞表达载体中，将表达载体转染至哺乳动物宿主细胞中，培养哺乳动物细胞，即可得到表达的目的蛋白。一种含上述人工合成的MAR共有序列的表达载体。所述的人工合成的MAR共有序列插入到表达载体的启动子上游。在该启动子上游，外源蛋白的表达量与不含有MAR片段的外源蛋白的表达量相比可提高5倍以上。所述启动子为SV40、CMV、EF-1α、CAG中的任意一种。上本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人工合成的MAR共有序列，其特征在于：由Human β‑globin MAR、Human MAR X‑29、Human MAR 1‑68、Human TOP1 MAR、Human HPRT MAR、Human MAR‑7、CHO MAR‑6、Human CSP‑B MAR、CHO DHFR intron MAR、Chicken lysozyme MAR、Human MAR‑2、Humanβ‑interferon MAR、Human MAR‑3中的至少两种的基序连接而成。

【技术特征摘要】
1.一种人工合成的MAR共有序列，其特征在于：由Humanβ-globinMAR、HumanMARX-29、HumanMAR1-68、HumanTOP1MAR、HumanHPRTMAR、HumanMAR-7、CHOMAR-6、HumanCSP-BMAR、CHODHFRintronMAR、ChickenlysozymeMAR、HumanMAR-2、Humanβ-interferonMAR、HumanMAR-3中的至少两种的基序连接而成。2.根据权利要求1所述的人工合成的MAR共有序列，其特征在于：由如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7所示的序列连接而成，或由如SEQIDNO.8、SEQIDNO.9、SEQIDNO.10、SEQIDNO.11、SEQIDNO.12、SEQIDNO.13、SEQIDNO.14、SEQIDNO.15、SEQIDNO.16、SEQIDNO.17所示的序列连接而成，或...

【专利技术属性】
技术研发人员：王天云，郭潇，田政伟，贾岩龙，王芳，宋超，王小引，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：河南,41