一种流感病毒HA融合肽和helix A蛋白制备方法及其应用与引物技术

本发明专利技术公开了一种流感病毒HA融合肽+helix A蛋白表达载体的制备方法及其应用与引物。本发明专利技术的原理和最核心的关键技术是科学地设计扩增出pGEX‑6p‑1线性化载体以及流感病毒HA融合肽‑helix A基因片段的引物，利用商品化的重组酶ExnaseTM II不经酶切连接反应，直接在体外快速重组克隆HA融合肽‑helix A，转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达、实现流感病毒HA融合肽‑helix A蛋白与GST的融合表达，并获得纯化的HA融合肽‑helix A融合蛋白。

【技术实现步骤摘要】
一种流感病毒HA融合肽和helixA蛋白制备方法及其应用与引物
本专利技术涉及一种流感病毒HA融合肽和helixA蛋白制备方法及其应用。此专利技术可直接提供HA融合肽和helixA融合蛋白作为免疫原获得抗HA融合肽和helixA多克隆抗体。本专利技术将为进一步探究HA的融合肽以及helix-A区域能否作为有效抗原表位，刺激机体产生中和抗体，评价其广谱流感中和亚单位疫苗打下了基础，提供了材料。
技术介绍
疫苗以及抗病毒药物的使用对流感病毒的防控作出了积极贡献。但由于流感病毒抗原的持续变异以及重组病毒的不断出现，时常导致人流感的大流行以及禽流感的爆发，严重影响人类健康以及畜牧业的持续发展。根据流感病毒表面两个主要抗原蛋白HA以及NA的抗原性，目前流感病毒可以分为18个HA以及11个NA亚群。根据HA的结构及其抗原性，18个HA亚群又可进一步归为GROUP1以及GROUP2两大类。值得注意的是，目前流感病毒疫苗均为亚群特异或毒株特异的疫苗，一般只能对相应的特定亚群或毒株提供有效保护，而对其它亚群或毒株往往不能提供有效保护。另外，流感病毒耐药毒株的不断出现也大大限制了抗流感病毒药物的使用。因此，筛选18个HA亚型中的保守中和表位，研制流感病毒广谱通用疫苗一直是流感病毒免疫防控研究中的一大热点。利用单克隆抗体技术，国内外研究发现，这些广谱的流感病毒中和抗原表位位于流感病毒HA的融合肽以及helixA区域。然而，HA的融合肽以及helixA区域能否作为流感病毒广谱亚单位疫苗尚无定论。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供一种流感病毒HA融合肽和helixA蛋白表达载体的制备方法及其应用与引物，并实现HA融合肽和helixA蛋白的表达。本专利技术的原理和最核心的关键技术是科学地设计扩增出pGEX-6p-1线性化载体以及流感病毒HA融合肽和helixA基因片段的引物，利用商品化的重组酶ExnaseTMII不经酶切连接反应，直接在体外快速重组克隆HA融合肽和helixA，转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达、实现流感病毒HA融合肽和helixA蛋白与GST的融合表达，并获得纯化的HA融合肽和helixA融合蛋白。本专利技术公开了PCR扩增pGEX-6p-1线性化载体引物以及PCR扩增AIV病毒HA融合肽和helixA基因引物序列，所述引物如下：a,PCR扩增pGEX-6p-1线性化载体引物：上游引物：5‘taatgacggtgaaaacctctgacacatgc3’；下游引物：5‘catgggcccctggaacagaacttccagat3’。b,PCR扩增AIV病毒HA融合肽和helixA基因引物：上游引物：5‘GTTCCAGGGGCCCATGGGAAGCggcctatttggtgctat3’；下游引物：5‘GTTTTCACCGTCATTAgtttaattttcctgt3’。本专利技术还公开了一种流感病毒HA融合肽和helixA蛋白制备方法：基于重组酶ExnaseTMII将线性化的pGEX-6p-1线性化载体与流感病毒HA融合肽和helixA基因片段PCR产物不经酶切连接反应，直接重组克隆技术；并转化到大肠杆菌，实现HA融合肽和helixA融合蛋白表达。设计扩增含pGEX-6p-1线性化载体以及AIV病毒HA融合肽和helixA基因片段引物：扩增pGEX-6p-1线性化载体上游引物位于pGEX-6p-1质粒1022-1047位；且在5‘端带有额外TAA碱基；扩增pGEX-6p-1线性化载体下游引物位于pGEX-6p-1质粒916-941位；且在5‘端带有额外CAT碱基。扩增AIV病毒HA融合肽和helixA基因上游引物增加了ATGGGAAGC为强启动子包括HA融合肽和helixA基因17个碱基，且在5‘端带有13个与pGEX-6p-1线性化载体下游引物反向互补的额外碱基；扩增AIV病毒HA融合肽和helixA基因下游引物包括HA融合肽和helixA基因终止密码TAA及其前15个碱基，且在5‘端带有13个与pGEX-6p-1线性化载体上游引物反向互补的额外碱基。具体引物序列见附表1，由南京Genscript金斯瑞生物科技有限公司合成。流感病毒HA融合肽和helixA蛋白表达载体构建及蛋白纯化：以商品化的pGEX-6p-1质粒以及含流感病毒HA融合肽和helixA基因的pcSH1-HA质粒为模版，利用表1中引物，PCR分别扩增出含pGEX-6p-1线性化载体以及流感病毒HA融合肽-+helixA基因片段(附图1，步骤1)；并利用重组酶ExnaseTMII进行快速重组克隆(附图1，步骤2)；阳性克隆转化到大肠杆菌，实现HA融合肽和helixA蛋白表达(附图1，步骤3)。本专利技术还公开了上述流感病毒HA融合肽和helixA蛋白的应用。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：第一，本专利技术设计的引物及基于重组酶ExnaseTMII的克隆策略，可快速构建流感病毒HA融合肽和helixA基因的原核表达载体。本专利技术获得的流感病毒HA融合肽和helixA表达及纯化的蛋白，可直接提供HA融合-helixA融合蛋白作为免疫原获得抗GST-HA融合肽和helixA多克隆抗体。本专利技术将为进一步探究HA的融合肽以及helix-A区域能否作为有效抗原表位，刺激机体产生中和抗体，评价其广谱流感中和亚单位疫苗打下了基础，提供了材料。因此，本专利技术具有一定应用价值。第二，本专利技术利用重组酶ExnaseTM一步克隆技术，成功构建流感病毒HA的融合肽以及helix-A区域的GST-HA-fusion-helixA融合表达蛋白，并通过免疫小鼠以及与病毒的反应证明所获得的GST-HA-fusion-helixA融合蛋白具有良好免疫原性。本专利技术为进一步探究HA的融合肽以及helix-A区域能否作为有效抗原表位，刺激机体产生中和抗体，评价其广谱流感中和亚单位疫苗打下了基础，提供了材料。附图说明图1是一种流感病毒HA融合肽和helixA蛋白制备方法流程图；步骤1：含流感病毒HA融合肽和helixA基因的pcSH1-HA质粒为模版，利用表1中引物，PCR分别扩增出含pGEX-6p-1线性化载体以及流感病毒HA融合肽和helixA基因片段。步骤2：利用重组酶ExnaseTMII进行快速重组克隆。步骤3：阳性克隆转化到大肠杆菌，实现HA融合肽和helixA融合蛋白的表达。步骤4：流感病毒HA融合肽和helixA融合蛋白纯化。图2是电泳分析PCR产物图；图2中：泳道1，扩增出的流感病毒HA融合肽和helixA基因片段；泳道2，扩增出的pGEX-6p-1线性化载体；M，DNAMarker。图3A是流感病毒HA融合肽和helixA基因的表达鉴定图(SDS-PAGE分析HA融合肽和helixA-GST蛋白的表达)；图3A中：泳道1、2、3、4、5,分别代表IPTG诱导的GST超声裂解样品上清及沉淀，IPTG诱导的HA融合肽和helixA-GST超声裂解样品上清及沉淀，HA融合肽和helixA-GST纯化后蛋白；M,预染的蛋白分子量；图3B是流感病毒HA融合肽和helixA基因的表达鉴定图(抗GST单抗分析HA融合肽和helixA-GST蛋白表达)图3B中：泳道1，IPTG诱导的GST超声裂解样品；泳道2，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.流感病毒HA融合肽和helix A蛋白制备用引物，包括：PCR扩增pGEX‑6p‑1线性化载体引物：SEQ ID NO.1上游引物：5‘taatgacggtgaaaacctctgacacatgc 3’；SEQ ID NO.2下游引物：5‘catgggcccctggaacagaacttccagat 3’；PCR扩增AIV病毒HA融合肽和helix A基因引物：SEQ ID NO.3上游引物：5‘GTTCCAGGGGCCCATGGGAAGCggcctatttggtgctat 3’；SEQ ID NO.4下游引物：5‘GTTTTCACCGTCATTAgtttaattttcctgt 3’。

【技术特征摘要】
1.流感病毒HA融合肽和helixA蛋白制备用引物，包括：PCR扩增pGEX-6p-1线性化载体引物：SEQIDNO.1上游引物：5‘taatgacggtgaaaacctctgacacatgc3’；SEQIDNO.2下游引物：5‘catgggcccctggaacagaacttccagat3’；PCR扩增AIV病毒HA融合肽和helixA基因引物：SEQIDNO.3上游引物：5‘GTTCCAGGGGCCCATGGGAAGCggcctatttggtgctat3’；SEQIDNO.4下游引物：5‘GTTTTCACCGTCATTAgtttaattttcctgt3’。2.一种流感病毒HA融合肽和helixA蛋白制备方法，其特征是，所述制备方法包括以下步骤：（1）pGEX-6p-1线性化载体PCR扩增以及流感病毒HA融合肽和helixA基因片段PCR扩增：以pGEX-6p-1质粒为模版，权利要求1所述的SEQIDNO.1、SEQIDNO.2为引物，进行HA2基因片段的PCR扩增，得到含pGEX-6p-1线性化载体Linear_pGEX-6p-1；以pcSH1-HA质粒为模版，权利要求1所述的SEQIDNO.3、SEQIDNO.4为引物，进行HA2基因片段的PCR扩增，得到流感病毒基因片段HA_fusion-helixA；（2）流感病毒HA融合肽和helixA基因片段HA_fusion-helixA快速克隆进pGEX-6p-1载体：将纯化的pGEX-6p-1线性化载体Linear_pGEX-6p-1以及流感病毒HA融合肽和helixA基因片段PCR产物HA_fusion-helixA在商品化重组酶ExnaseTMII的作用下进行重组克隆；（3）流感病毒HA融合肽和helixA可溶性蛋白诱导表达：将步骤（2）得到含流感病毒HA融合肽和helixA基因的阳性克隆转化到大肠杆菌，实现HA融合肽和helixA蛋白表达。3.根据权利要求2所述的一种流感病毒HA融合肽和helixA蛋白制备方法，其特征是，所述pGEX-6p-1线性化载体PCR扩增反应体系为：40μl水，5μl10倍缓冲液，1μl10mMdNTP，1μl10μmol上游引物，1μl10μmol下游引物,1μl10ng/μl的pGEX-6p-1质粒，1μl商品化的PhantaSup...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶建强，李占萍，邵红霞，秦爱建，万志敏，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32