一种甘蔗梢腐病病原菌原生质体制备与再生的方法技术

本发明专利技术公开了一种甘蔗梢腐病病原菌原生质体制备与再生的方法，该方法具体操作步骤如下：(1)甘蔗梢腐病病原菌孢悬液的制备；(2)新鲜菌丝体的制备；(3)溶壁酶的配置；(4)菌丝细胞壁的酶解；(5)原生质体收集；(6)原生质体再生；(7)再生情况的调查。本发明专利技术成本低，操作简单，对设备要求低，同时酶解时间及再生周期短，大大提高了甘蔗梢腐病病原菌原生质体的制备效率，较好的保持了原生质体活性，具有较强的再生能力，有利于后续病原菌的遗传转化和转化子的筛选。

A method of protoplast preparation and regeneration of sugarcane shoot rot pathogen

The invention discloses a method for preparation and regeneration of protoplast of sugarcane shoot rot pathogen. The specific operation steps of the method are as follows: (1) preparation of spore suspension of sugarcane shoot rot pathogen; (2) preparation of fresh mycelium; (3) configuration of lysozyme; (4) enzymatic hydrolysis of mycelium cell wall; (5) collection of protoplast; (6) protoplast regeneration; (7) investigation of regeneration. The invention has the advantages of low cost, simple operation, low requirement for equipment, short enzymatic hydrolysis time and regeneration period, greatly improving the preparation efficiency of protoplast of pathogenic bacteria of sugarcane shoot rot, better maintaining protoplast activity, strong regeneration ability, and favorable for subsequent genetic transformation of pathogenic bacteria and screening of transformers.

【技术实现步骤摘要】
一种甘蔗梢腐病病原菌原生质体制备与再生的方法
本专利技术涉及分子植物病理学中真菌原生质体的制备与再生
，具体涉及一种甘蔗梢腐病病原菌原生质体制备与再生的方法。
技术介绍
甘蔗梢腐病(PokkahBoeng)是由镰刀菌(GibberellafujikuroiSaw.)引起的一种真菌性病害。引起甘蔗梢腐病的镰刀菌种类繁多，其中包括Fusariummoniliforme、Fusariumproliferatum、Fusariumverticillioides等，不同地区镰刀菌的优势菌不同，我国发现的甘蔗梢腐病病原菌主要以轮状镰刀霉菌(Fusariumverticillioides)为主。甘蔗梢腐病病原菌主要通过气流传播到甘蔗心叶侵染为害，造成叶片死亡，植株生长受阻，严重可造成植株死亡，导致甘蔗减产5％-20％，甘蔗糖分降低3％，对感病甘蔗品种造成的影响更加显著。我国各甘蔗生产区均有发生梢腐病危害，近几年，甘蔗梢腐病在我国广大蔗区呈现出了逐渐加重的趋势。目前，利用原生质体进行分子遗传转化已成为真菌转化和致病机理研究的重要组成部分，分子转化必须依赖于制备高效、活性高、可再生的原生质体。对于甘蔗梢腐病病原菌原生质体的制备尚未有相关报道，为了筛选甘蔗梢腐病病原菌致病力变异菌株，加强对病原菌致病机制进行研究，为甘蔗抗病育种提供理论基础，需要对甘蔗梢腐病病原菌原生质体的制备与再生进行研究。
技术实现思路
为了克服上述现有技术中的不足，本专利技术目的在于提供一种甘蔗梢腐病病原菌原生质体制备与再生的方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种甘蔗梢腐病病原菌原生质体制备与再生的方法，包括如下步骤，(1)甘蔗梢腐病病原菌孢悬液的制备：将病原菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基中活化，然后挑取菌落边缘的菌丝接种于马铃薯葡萄糖水PDW培养基中，于恒温摇床中培养，离心法收集菌体，无菌水配制成孢悬液；(2)新鲜菌丝体的制备：取配制好的孢悬液1ml接种于100ml马铃薯葡萄糖水PDW培养基中，恒温摇床中培养，经灭菌擦镜纸过滤获取新鲜菌丝体，用预冷0.8mol/LNaCl溶液充分洗涤；(3)溶壁酶的配置：称取100mg溶壁酶，用预冷0.8mol/LNaCl溶液配制成10mg/ml酶液，经微孔滤膜过滤除菌后备用；(4)菌丝细胞壁的酶解：取0.5g新鲜菌丝体，加入10ml溶壁酶，于恒温摇床中培养，期间每半小时进行显微镜检查一次；观察原生质体产生情况，避免过度酶解导致原生质体破裂。(5)原生质体收集：用灭菌擦镜纸过滤步骤(4)的酶解液以除去未被酶解的菌丝残体，用预冷0.8mol/LNaCl溶液洗涤滤液，离心分离，弃上清液，用山梨醇溶液STC溶解沉淀，并在光学显微镜下计数，调节原生质体浓度为1×107个/ml，分装于1.5ml离心管中，于-80℃冰箱中保存备用；(6)原生质体再生：取制备好的原生质体悬浮液用0.8mol/L蔗糖溶液稀释100倍，用直接涂布法，吸取200μl原生质体稀释液涂布于再生培养基上，放置于恒温培养箱中培养；同时取等体积的原生质体悬浮液用无菌水稀释，吸取200μl原生质体稀释液涂布于马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基上，作为对照；(7)再生情况的调查：设再生培养基上长出的菌落数为A，对照菌落数为B，则原生质体再生率＝(A-B)×100/原生质体总数×100％。作为技术方案的优选，所述马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基、马铃薯葡萄糖水PDW培养基、再生培养基和蔗糖溶液经过121℃高压灭菌20min后使用，所述马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基、马铃薯葡萄糖水PDW培养基、再生培养基中含100μg/ml氨苄青霉素。作为技术方案的优选，所述步骤(1)将病原菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基中活化3-4d，然后挑取菌落边缘的菌丝接种于100ml马铃薯葡萄糖水PDW培养基中，于转速为220rpm，温度为28℃的恒温摇床中培养3～4d。作为技术方案的优选，所述步骤(2)中接种孢悬液后的马铃薯葡萄糖水PDW培养基在转速为220rpm，温度为28℃的恒温摇床中培养的时间为18-20h。作为技术方案的优选，所述0.8mol/LNaCl溶液用0.1mol/LPH5.5-6.0的磷酸缓冲液溶解NaCl配制而成，于121℃高压灭菌20min后，放置于4℃冰箱中进行预冷保存备用。作为技术方案的优选，所述灭菌擦镜纸过滤时，灭菌擦镜纸层数为4-6层。作为技术方案的优选，所述步骤(3)中微孔滤膜的孔径为0.22μm。作为技术方案的优选，所述步骤(5)中离心分离的时间为10min，转速为5000rpm。作为技术方案的优选，所述步骤(5)中山梨醇溶液STC的配制方法为：先配置好pH为7.5，浓度为的10mmol/L的Tris-HCl，再添加山梨醇和CaCl2，使山梨醇浓度为1.2mol/L、CaCl2浓度为10mmol/L；配置好的山梨醇溶液STC于121℃高压灭菌20min后，放置于4℃冰箱中保存备用。作为技术方案的优选，所述步骤(6)中再生培养基为添加了0.8mol/L蔗糖溶液的马铃薯葡萄糖琼脂。作为技术方案的优选，步骤(6)中经原生质体涂布后的再生培养基放置于28℃恒温培养箱中培养3-5d。本专利技术中的马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基，马铃薯葡萄糖水PDW培养基均是采用现有公开的配方进行配置。本专利技术具有以下有益效果：(1)本专利技术成本低，操作简单，对设备要求低，同时酶解时间及再生周期短，大大提高了甘蔗梢腐病病原菌原生质体的制备效率，较好的保持了原生质体活性，具有较强的再生能力，有利于后续病原菌的遗传转化和转化子的筛选。(2)采用本专利技术所述方法制备的原生质体数量多，数量可达到2.7×107个/ml，活性保持较好，再生能力强，再生率最高可达24.8％。(3)本专利技术的接种孢悬液的马铃薯葡萄糖水PDW培养基恒温培养的时间为18h进行菌丝体的培养，选择该时间是因为，此时的菌丝体刚从孢子中萌发出来，处于快速生长期，非常幼嫩，释放的原生质体数量多，不易裂解，活性高；并且此时培养基刚好被完全消耗，充分利用资源。(4)本专利技术进行细菌丝细胞壁的酶解的溶壁酶浓度为10mg/ml，该浓度溶壁酶的浓度低，使用少量即可实现细胞壁的酶解，成本低，效率高，操作简便。(5)本专利技术所述方法选择0.8mol/LNaCl溶液作为渗透压稳定剂，用以维持原生质体内外的渗透压平衡，同时在该浓度下溶壁酶的活性可以得到进一步的提高，提高酶解的速率。附图说明图1为本专利技术原生质体在显微镜下的观察图。具体实施方式为了使本
的人员更好的理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例来对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请的一部分实施例，基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。实施例1一种甘蔗梢腐病病原菌原生质体制备与再生的方法，包括如下步骤，(1)甘蔗梢腐病病原菌孢悬液的制备：将病原菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基中活化3d，然后挑取菌落边缘的菌丝接种于马铃薯葡萄糖水PDW培养基中，于转速为220rpm，温度为28℃的恒温摇床中培养3d，离心法收集菌体，无菌水配制成孢悬液；(2)新鲜菌丝体的制备：取配制好的孢本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种甘蔗梢腐病病原菌原生质体制备与再生的方法，其特征在于：包括如下步骤，(1)甘蔗梢腐病病原菌孢悬液的制备：将病原菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基中活化，然后挑取菌落边缘的菌丝接种于马铃薯葡萄糖水PDW培养基中，于恒温摇床中培养，离心法收集菌体，无菌水配制成孢悬液；(2)新鲜菌丝体的制备：取配制好的孢悬液1ml接种于100ml马铃薯葡萄糖水PDW培养基中，恒温摇床中培养，经灭菌擦镜纸过滤获取新鲜菌丝体，用预冷0.8mol/L NaCl溶液充分洗涤；(3)溶壁酶的配置：称取100mg溶壁酶，用预冷0.8mol/L NaCl溶液配制成10mg/ml酶液，经微孔滤膜过滤除菌后备用；(4)菌丝细胞壁的酶解：取0.5g新鲜菌丝体，加入10ml溶壁酶，于恒温摇床中培养，期间每半小时进行显微镜检查一次；(5)原生质体收集：用灭菌擦镜纸过滤步骤(4)的酶解液以除去未被酶解的菌丝残体，用预冷0.8mol/L NaCl溶液洗涤滤液，离心分离，弃上清液，用山梨醇溶液STC溶解沉淀，并在光学显微镜下计数，调节原生质体浓度为1×107个/ml，分装于1.5ml离心管中，于‑80℃冰箱中保存备用；(6)原生质体再生：取制备好的原生质体悬浮液用0.8mol/L蔗糖溶液稀释100倍，用直接涂布法，吸取200μl原生质体稀释液涂布于再生培养基上，放置于恒温培养箱中培养；同时取等体积的原生质体悬浮液用无菌水稀释，吸取200μl原生质体稀释液涂布于马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基上，作为对照；(7)再生情况的调查：设再生培养基上长出的菌落数为A，对照菌落数为B，则原生质体再生率＝(A‑B)×100/原生质体总数×100％。...

【技术特征摘要】
1.一种甘蔗梢腐病病原菌原生质体制备与再生的方法，其特征在于：包括如下步骤，(1)甘蔗梢腐病病原菌孢悬液的制备：将病原菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基中活化，然后挑取菌落边缘的菌丝接种于马铃薯葡萄糖水PDW培养基中，于恒温摇床中培养，离心法收集菌体，无菌水配制成孢悬液；(2)新鲜菌丝体的制备：取配制好的孢悬液1ml接种于100ml马铃薯葡萄糖水PDW培养基中，恒温摇床中培养，经灭菌擦镜纸过滤获取新鲜菌丝体，用预冷0.8mol/LNaCl溶液充分洗涤；(3)溶壁酶的配置：称取100mg溶壁酶，用预冷0.8mol/LNaCl溶液配制成10mg/ml酶液，经微孔滤膜过滤除菌后备用；(4)菌丝细胞壁的酶解：取0.5g新鲜菌丝体，加入10ml溶壁酶，于恒温摇床中培养，期间每半小时进行显微镜检查一次；(5)原生质体收集：用灭菌擦镜纸过滤步骤(4)的酶解液以除去未被酶解的菌丝残体，用预冷0.8mol/LNaCl溶液洗涤滤液，离心分离，弃上清液，用山梨醇溶液STC溶解沉淀，并在光学显微镜下计数，调节原生质体浓度为1×107个/ml，分装于1.5ml离心管中，于-80℃冰箱中保存备用；(6)原生质体再生：取制备好的原生质体悬浮液用0.8mol/L蔗糖溶液稀释100倍，用直接涂布法，吸取200μl原生质体稀释液涂布于再生培养基上，放置于恒温培养箱中培养；同时取等体积的原生质体悬浮液用无菌水稀释，吸取200μl原生质体稀释液涂布于马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基上，作为对照；(7)再生情况的调查：设再生培养基上长出的菌落数为A，对照菌落数为B，则原生质体再生率＝(A-B)×100/原生质体总数×100％。2.根据权利要求1所述的甘蔗梢腐病病原菌原生质体制备与再生的方法，其特征在于：所述马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基、马铃薯葡萄糖水PDW培养基、再生培养基和蔗糖溶液经过121℃高压灭菌20min后使用；所述马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基、马铃薯葡萄糖水PDW培养基、再生培养基中含100μg/ml氨苄青霉素。3.根据权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭强，马文清，唐利球，陈海生，秦昌鲜，彭崇，闭德金，施泽升，何洪良，刘连军，廖韦卫，江清梅，罗晟昇，蒋亚琴，韦海球，
申请(专利权)人：广西南亚热带农业科学研究所，
类型：发明
国别省市：广西,45