一种鸭甲肝病毒的抗原表位肽及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种鸭甲肝病毒的抗原表位肽及其应用，抗原表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。该抗原表位肽的制备方法如下：使用合成的多肽与KLH载体蛋白通过半胱氨酸残基耦联作为抗原免疫小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓细胞进行融合，筛选得到杂交瘤细胞系，制备单克隆抗体；SPF鸭胚上中和试验筛选同时可以中和基因C型和A型鸭甲肝病毒的单克隆抗体，测定其对应的杂交瘤细胞株所识别的抗原表位肽序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；人工合成SEQ ID NO.4所示多肽与KLH载体蛋白耦联作为抗原免疫蛋鸡，提取纯化卵黄抗体。本发明专利技术卵黄抗体可有效预防和治疗鸭甲肝病毒引起的疾病。

An Antigen Epitope Peptide of Duck Hepatitis A Virus and Its Application

The invention discloses an antigen epitope peptide of duck hepatitis A virus and its application. The amino acid sequence of the antigen epitope peptide is shown in SEQ ID NO.4. The preparation methods of the epitope peptide were as follows: the synthesized polypeptide and KLH carrier protein were coupled with cysteine residue as antigen to immunize mice. Spleen cells of mice were fused with SP2/0 bone marrow cells to screen hybridoma cell lines and prepare monoclonal antibodies; SPF duck embryo neutralization test screened monoclonal antibodies that could neutralize both genotype C and type A duck hepatitis A virus. The sequence of antigen epitope peptides identified by the corresponding hybridoma cell lines was determined. The amino acid sequence was shown as SEQ ID NO.4. The synthetic SEQ ID NO.4 polypeptide was coupled with KLH carrier protein as antigen to immunize laying hens, and the yolk antibody was extracted and purified. The yolk antibody of the invention can effectively prevent and treat diseases caused by duck hepatitis A virus.

【技术实现步骤摘要】
一种鸭甲肝病毒的抗原表位肽及其应用
本专利技术属于基因工程和分子生物学
，具体地说，涉及一种鸭甲肝病毒的抗原表位肽及其应用。
技术介绍
鸭病毒性肝炎(Duckviralhepatitis,DVH)是由鸭肝炎病毒(Duckhepatitisvirus,DHV)引起的一种主要危害3周龄以内雏鸭的急性、高度致死性传染病。DHV包括小RNA病毒科和星状病毒科成员，而小RNA病毒科的DHV又被命名为鸭甲肝病毒(duckhepatitisAvirus，DHAV)，根据基因型结构的差异，DHAV又分为基因A型(DHAV-A)、B型(DHAV-B)和C型(DHAV-C)三种基因型。其中在我国流行的传统Ⅰ型DHV为基因A型DHAV，中国台湾地区新发的为基因B型，而近年来，韩国样新型或称基因C型的DHAV在我国的地区分布已较为广泛，基因A型和C型DHAV在我国许多养鸭地区的同时流行是我国许多鸭场针对传统的Ⅰ型DHV采取措施后仍发生DVH的根本原因。因此找到一个基因A型和C型DHAV共有的抗原表位用于鸭病毒性肝炎高免血清或者高免卵黄抗体的制备对于该病的防控和紧急治疗都具有重要的意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种鸭甲肝病毒的抗原表位肽及其应用，可以用于制备同时可以中和基因A型和C型鸭甲肝病毒感染的高免抗体。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种鸭甲肝病毒的抗原表位肽，其氨基酸序列如SEQIDNO.4所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有相同免疫原性和相同抗原性的氨基酸序列。本专利技术还公开了一种上述的鸭甲肝病毒的抗原表位肽在制备灭活疫苗中的应用。本专利技术还公开了一种上述的鸭甲肝病毒的抗原表位肽在制备卵黄抗体中的应用。本专利技术还公开了一种预防和治疗鸭甲肝病毒病的卵黄抗体，在制备过程中采用了上述的抗原表位肽，在合成抗原表位肽过程中在抗原表位肽的C-端加上半胱氨酸残基，用Thermo的SMPH双性多肽耦联试剂将多肽片段和KLH载体蛋白通过半胱氨酸耦联；卵黄抗体效价不小于1:512。本专利技术还公开了一种上述的卵黄抗体在制备用于预防和治疗鸭甲肝病毒病的药物中的应用。可选地，所述鸭甲肝病毒为A型和C型鸭甲肝病毒。本专利技术还公开了一种上述的鸭甲肝病毒的抗原表位肽的制备方法，包括以下步骤：(1)合成多肽TKNIEDETVK，KWSRNHRPFR，NLFESKLTPY，TTHQIETVTI，PEIPKYDGPI,SSFKQDVMDQ,MDQIQSPSTV，PVLEIQPWGV，GVARMRAYTA每条多肽的C-端加上半胱氨酸残基；(2)将上述多肽混合并与KLH载体蛋白通过半胱氨酸残基耦联作为抗原；(3)将制备好的抗原免疫6周龄BALB/c健康小鼠，按常规的单克隆抗体制备过程制备和纯化单克隆抗体；(4)用纯化得到单克隆抗体在SPF鸭胚上做中和试验筛选同时能够中和基因C型和A型鸭甲肝病毒的单克隆抗体；(5)筛选到的具有中和活性的单克隆抗体所识别的抗原多肽表位即SEQIDNO.4所示。与现有技术相比，本专利技术可以获得包括以下技术效果：采用本专利技术提供的抗原表位肽制备的卵黄抗体具有安全性好、特异性高、治疗效果好、生产成本低等优点，可有效预防和治疗鸭甲肝病毒引起的疾病，应用前景良好。当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。具体实施方式以下将配合实施例来详细说明本专利技术的实施方式，借此对本专利技术如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。实施例1：单克隆抗体的制备1.1抗原制备合成TKNIEDETVK，KWSRNHRPFR，NLFESKLTPY，TTHQIETVTI，PEIPKYDGPI,SSFKQDVMDQ,MDQIQSPSTV，PVLEIQPWGV，GVARMRAYTA等9条多肽，每个多肽合成500μg。在合成多肽过程中在多肽的C-端加上半胱氨酸残基，用Thermo的SMPH双性多肽耦联试剂将多肽片段和KLH载体蛋白通过半胱氨酸耦联，作为抗原。提供抗原偶联过程：1、将20mgSMPH溶于2mlDMF。2、将0.8mlKLH加入到25ml圆底烧瓶中，补加1×PBS(pH7.2)使蛋白终浓度为15mg/ml。3、将溶解好的SMPH溶液缓慢滴加到120mgKLH蛋白体系中，室温搅拌反应1h。4、用1L1×PBS(PH7.4)溶液于4℃下透析6小时，除去游离的SMPH。5、将透析后的KLH蛋白倒入50ml离心管中，通过离心管的刻度确定其体积，根据反应前加入的KLH蛋白的量来计算透析后蛋白的浓度，然后根据其浓度将2.5mgKLH-SMPH溶液转移到5ml离心管中。6、将3.0mg合成的混合多肽用0.6ml1×PBS(pH7.2)溶液溶解。7、用Ellman试剂检测多肽中的巯基：在96孔板中加入100μlEllman试剂储备液，再加入10μl多肽溶液，用Nano分光光度计在λ＝412nm下测其紫外吸收值，如果OD值>0.15做下一步；OD值<0.15并>0.05补加多肽，直至达到要求；OD值<0.05返回多肽合成步骤重新质控。Ellman试剂是用来检测游离巯基的，如果检测液显黄色说明多肽的Cys的巯基大部分以游离态存在；如果检测液不显黄色则说明多肽Cys中的巯基已经被氧化形成二聚体或多聚体。8、将多肽液滴加到KLH-SMPH管中，室温下用垂直混匀器混匀反应4小时。9、用Ellman试剂检测多肽中的巯基：在96孔板中加入100μlEllman试剂储备液，再加入10μl校验后的多肽溶液，用Nano分光光度计在λ＝412nm下测定紫外吸收值。OD值<0.03说明多肽和KLH蛋白交联率已达到80％以上；OD值>0.03则再补加SMPH活化好的KLH蛋白继续交联。如果Ellman试剂显黄色说明多肽与KLH蛋白偶联不完全；如果Ellman试剂不显黄色则说明多肽已经全部与KLH蛋白偶联。1.2动物免疫将制备好的抗原免疫6周龄BALB/c健康小鼠。抗原(100微克)与弗氏完全佐剂1:1混合，腹腔注射；2周后加强免疫1次，抗原(100微克)与弗氏不完全佐剂1:1混合，腹腔注射；之后每隔1周加强免疫一次，第4次增强免疫注射100微克抗原，免疫后第3天，将小鼠脱颈椎处死，无菌取脾脏用于细胞融合。1.3杂交瘤细胞株的制备与筛选按常规的细胞融合技术融合：取免疫小鼠的脾脏和SP2/0骨髓细胞进行融合，加入小鼠的胸腺细胞与融合细胞在HAT培养系中共培养。以合成的多肽作为包被抗原，用间接ELISA方法和系列稀释法进行筛选，经过3次克隆化，直至所有克隆化细胞孔检测阳性率为100％，获得10株稳定分泌MAb的杂交瘤细胞株，这10株杂交瘤细胞株识别的表位序列见表1。表1杂交瘤细胞识别的表位序列1.4单克隆抗体腹水的制备取6～8周龄Balb/C小鼠，腹腔内注射无菌的液体石蜡0.5ml/只；1周后，腹腔内分别注射10株阳性杂交瘤细胞株；接种杂交瘤细胞株后7～10天，见小鼠腹部明显膨大，抽腹水，离心后收集上清，-80℃冻存得到10个单克隆抗体的粗品备用。实施例2：单克隆抗体中和鸭甲肝病毒活性的鉴定2.1基因C型和A型鸭甲肝病毒的鸭胚半数本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸭甲肝病毒的抗原表位肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有相同免疫原性和相同抗原性的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种鸭甲肝病毒的抗原表位肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.4所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有相同免疫原性和相同抗原性的氨基酸序列。2.权利要求1所述鸭甲肝病毒的抗原表位肽在制备灭活疫苗中的应用。3.权利要求1所述鸭甲肝病毒的抗原表位肽在制备卵黄抗体中的应用。4.一种预防和治疗鸭甲肝病毒病的卵黄抗体，其特征在于，在制备过程中采用了权利要求1所述的抗原表位肽，在合成抗原表位肽过程中在抗原表位肽的C-端加上半胱氨酸残基，用Thermo的SMPH双性多肽耦联试剂将多肽片段和KLH载体蛋白通过半胱氨酸耦联；卵黄抗体效价不小于1:512。5.权利要求3或4所述的卵黄抗体在制备用于预防和治疗鸭甲肝病毒病的药物中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述鸭甲肝...

【专利技术属性】
技术研发人员：岳华，汤承，王远微，
申请(专利权)人：西南民族大学，
类型：发明
国别省市：四川,51