C4′-氟代尿苷亚磷酰胺单体和C4′-氟代尿苷修饰RNA的制备方法技术

本发明专利技术涉及RNA的化学合成领域，公开C4′‑氟代尿苷亚磷酰胺单体及其C4′‑氟代尿苷定点修饰的RNA的制备方法。该C4′‑氟代尿苷亚磷酰胺单体的化学结构如式(1)所示。本发明专利技术所述的C4′‑氟代尿苷亚磷酰胺单体用于制备C4′‑氟代尿苷定点修饰的RNA，在研究C4′‑氟代RNA的生化性质等方面有着广泛的应用前景。

Preparation of C4'-fluorouracil phosphite monomer and C4'-fluorouracil modified RNA

The invention relates to the field of RNA chemical synthesis, and discloses the preparation method of C4' The chemical structure of the C4'fluorouracil phosphite amide monomer is shown in formula (1). The C4'fluorouracil phosphorous amide monomer of the invention is used to prepare locally modified RNA of C4' fluorouracil, and has broad application prospects in studying the biochemical properties of the C4'fluorouracil RNA.

【技术实现步骤摘要】
C4′-氟代尿苷亚磷酰胺单体和C4′-氟代尿苷修饰RNA的制备方法
本专利技术涉及寡聚核苷酸的化学合成领域，具体涉及C4′-氟代尿苷亚磷酰胺单体以及C4′-氟代尿苷定点修饰RNA的制备方法。
技术介绍
氟代修饰的RNA在生物医学领域有广泛的应用前景[Org.Biomol.Chem.,2017,15,9552–9565]。C2′-氟代修饰的RNA成功应用于核酸适配体、小干扰RNA等，可以增强稳定性，提高效力[Nature,2011,478,404-408]。此外，C4′-氟修饰核苷类似物nucleocidin是天然存在的五种含氟天然产物之一，具有良好的抗代谢活性，C4′-氟代修饰的核苷也因此引起了关注。Guillerm[Bioorg.Med.Chem.Lett.1995,5,1455-1460]和Verdine[Org.Lett.,2007,9,5007-5009]分别发展了各自的方法合成了C4′-氟代核苷。然而C4′-氟代核苷不稳定，将C4′-氟代核苷转化为C4′-氟亚磷酰胺单体并制备C4′-氟代修饰的RNA一直没有成功，限制了对其生化性质的进一步探讨。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对C4′-氟代核苷不稳定的实际问题，提供一种通过分阶段、选择性保护核糖核苷中羟基的策略，即C4′-氟代尿苷亚磷酰胺单体及其制备方法，以及利用C4′-氟代尿苷磷酰胺单体制备C4′-氟代尿苷定点修饰的RNA的方法。本专利技术技术方案1、为了实现上述目的，本专利技术第一方面提供了一种C4′-氟代尿苷亚磷酰胺单体，其中，该C4′-氟代尿苷亚磷酰胺单体的化学结构式为：式(1)所示的化合物可以称为2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-[(2-氰基乙氧基)-N,N′-二异丙基亚磷酰胺]-4′-C-氟-5′-O-二甲氧基三苯甲基尿苷。其中，在式(1)中，“DMTr-”为二甲氧基三苯甲基，“N(iPr)2-”为N,N-二异丙基胺基，“-TBDMS”为叔丁基二甲基硅烷基。2、本专利技术第二方面提供了一种C4′-氟代尿苷亚磷酰胺单体的制备方法，该方法包括以下步骤：(1)将4′-C-氟-5′-碘-5′-脱氧尿苷与硝酸银、吡啶和四氢呋喃形成第一混合溶液；之后将所述第一混合溶液与叔丁基二甲基氯硅烷进行反应，将反应后得到的溶液旋蒸除去溶剂，用二氯甲烷溶解后洗涤、过滤、干燥、柱层析得到2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-氟-5′-碘-5′-脱氧尿苷。(2)将步骤(1)得到的2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-氟-5′-碘-5′-脱氧尿苷与4-二甲氨基吡啶、吡啶进行第二混合，形成第二混合溶液；再将所述第二混合溶液与乙酸酐进行反应；旋蒸除去溶剂，用二氯甲烷溶解后洗涤、过滤、干燥、柱层析得到2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-乙酸酯-4′-C-氟-5′-碘-5′-脱氧尿苷。(3)将三氟乙酸与四正丁基氢氧化铵溶液混合调节pH后，加入步骤(2)得到的2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-乙酸酯-4′-C-氟-5′-碘-5′-脱氧尿苷、二氯甲烷进行第三混合，形成第三混合溶液；再将所述第三混合溶液与间氯过氧苯甲酸进行反应；然后将反应得到的有机相洗涤、过滤、干燥、柱层析得到2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-乙酸酯-4′-C-氟代尿苷。(4)将步骤(3)得到的2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-乙酸酯-4′-C-氟代尿苷与氨/甲醇溶液进行反应；旋蒸除去溶剂，柱层析得到产物。(5)将步骤(4)得到的产物与4-二甲氨基吡啶、吡啶以及4,4′-二甲氧基三苯甲基氯进行反应；旋蒸除去溶剂，用二氯甲烷溶解后然后将有机相洗涤、过滤、干燥、柱层析得到2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-氟-5′-O-二甲氧基三苯甲基尿苷。(6)将步骤(5)得到的2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-氟-5′-O-二甲氧基三苯甲基尿苷与二氯甲烷、N,N′-二异丙基乙胺以及2-甲基咪唑进行第四混合，形成第四混合溶液；再将所述第四混合溶液与(2-氰基乙氧基)-N,N′-二异丙基亚磷酰氯进行反应；旋蒸除去溶剂，用二氯甲烷溶解后然后将有机相洗涤、过滤、干燥、柱层析得到2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-[(2-氰基乙氧基)-N,N′-二异丙基亚磷酰胺]-4′-C-氟-5′-O-二甲氧基三苯甲基尿苷，即本专利技术所述的C4′-氟代尿苷亚磷酰胺单体。优选地，在步骤(1)中，所述4′-C-氟-5′-碘-5′-脱氧尿苷与所述硝酸银、所述吡啶、所述四氢呋喃、所述叔丁基二甲基氯硅烷用量的比为1mmol:3.5mmol:4mL:4mL:3.5mmol；以及，所述反应的条件包括：温度为18-25℃，时间为1.5-2小时，搅拌速度为250-500转/分钟。优选地，在步骤(2)中，所述2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-氟-5′-碘-5′-脱氧尿苷与所述4-二甲氨基吡啶、所述吡啶、所述乙酸酐用量的比为1mmol:0.3mmol:10mL:5mmol；以及，所述乙酸酐以滴加的方式加入所述第二混合溶液中，所述乙酸酐的滴加速率为15滴/分钟；以及，所述反应的条件包括：温度为18-25℃，时间为0.5-1小时，搅拌速度为250-500转/分钟。优选地，在步骤(3)中，所述三氟乙酸与所述四正丁基氢氧化铵溶液、所述2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-乙酸酯-4′-C-氟-5′-碘-5′-脱氧尿苷、所述二氯甲烷、所述间氯过氧苯甲酸的用量比为0.8mL:10mL:1mmol:10mL:5mmol；其中所述四正丁基氢氧化铵溶液的质量浓度为55％，所述间氯过氧苯甲酸的纯度为85％；所述三氟乙酸以滴加的方式加入所述四正丁基氢氧化铵溶液中调pH为4；所述间氯过氧苯甲酸分三次加入第三混合溶液中，间隔时间为0.5小时；以及，所述反应的条件包括：温度为18-25℃，时间为40-46小时，搅拌速度为250-500转/分钟。优选地，在步骤(4)中，所述2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-乙酸酯-4′-C-氟代尿苷与氨/甲醇溶液用量比为1mmol:8mL，其中氨/甲醇溶液的物质的量浓度为7mol/L；以及，所述反应的条件包括：温度为18-25℃，时间为3-4小时，搅拌速度为250-500转/分钟。优选地，在步骤(5)中，所述产物与所述4-二甲氨基吡啶、所述吡啶以及4,4′-二甲氧基三苯甲基氯的用量比为1mmol:0.3mmol:8mL:1.3mmol；以及，所述反应的条件包括：温度为40-50℃，时间为3-5小时，搅拌速度为250-500转/分钟。优选地，在步骤(6)中，所述2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-氟-5′-O-二甲氧基三苯甲基尿苷与所述二氯甲烷、所述N,N′-二异丙基乙胺、所述2-甲基咪唑、所述(2-氰基乙氧基)-N,N′-二异丙基亚磷酰氯的用量比为1mmol:20mL:10mmol:4mmol:5mmol；以及，所述反应的条件包括：温度为18-25℃，时间为15分钟，搅拌速度为250-500转/分钟。3、本专利技术第三方面提供了一种C4′-氟代尿苷定点修饰RNA的制备方法，其中，该制备方法中的合成试剂包括以上所述的制备方法制备得到的C4′-氟代尿苷亚磷酰胺单体。优选地，该制备方法在ABI39本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种C4′‑氟代尿苷亚磷酰胺单体，其特征在于，其化学结构式为：

【技术特征摘要】
1.一种C4′-氟代尿苷亚磷酰胺单体，其特征在于，其化学结构式为：式(1)中“DMTr-”为二甲氧基三苯甲基，“N(iPr)2-”为N,N-二异丙基胺基，“TBDMS”为叔丁基二甲基氯硅烷。2.一种权利要求1所述C4′-氟代尿苷亚磷酰胺单体的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)将4′-C-氟-5′-碘-5′-脱氧尿苷与硝酸银、吡啶和四氢呋喃形成第一混合溶液；之后将所述第一混合溶液与叔丁基二甲基氯硅烷进行反应，且所述4′-C-氟-5′-碘-5′-脱氧尿苷与所述硝酸银、所述吡啶、所述四氢呋喃和所述叔丁基二甲基氯硅烷的用量比为1mmol:3.5mmol:4mL:4mL:3.5mmol，将反应后得到的溶液旋蒸除去溶剂，再用二氯甲烷溶解后洗涤、过滤、干燥、柱层析得到2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-氟-5′-碘-5′-脱氧尿苷；(2)将步骤(1)得到的2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-氟-5′-碘-5′-脱氧尿苷与4-二甲氨基吡啶、吡啶进行第二混合，形成第二混合溶液；再将所述第二混合溶液与乙酸酐进行反应，所述2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-氟-5′-碘-5′-脱氧尿苷与所述4-二甲氨基吡啶、所述吡啶、所述乙酸酐用量的比为1mmol:0.3mmol:10mL:5mmol；旋蒸除去溶剂，用二氯甲烷溶解后洗涤、过滤、干燥、柱层析得到2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-乙酸酯-4′-C-氟-5′-碘-5′-脱氧尿苷；(3)将三氟乙酸与四正丁基氢氧化铵溶液混合调节pH为4后，加入步骤(2)得到的2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-乙酸酯-4′-C-氟-5′-碘-5′-脱氧尿苷、二氯甲烷进行第三混合，形成第三混合溶液；再将所述第三混合溶液与间氯过氧苯甲酸进行反应，且所述三氟乙酸与所述四正丁基氢氧化铵溶液、所述2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-乙酸酯-4′-C-氟-5′-碘-5′-脱氧尿苷、所述二氯甲烷、所述间氯过氧苯甲酸的用量比为0.8mL:10mL:1mmol:10mL:5mmol；然后将反应得到的有机相洗涤、过滤、干燥、柱层析得到2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-乙酸酯-4′-C-氟代尿苷；(4)将步骤(3)得到的2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-乙酸酯-4′-C-氟代尿苷与氨/甲醇溶液进行反应，且所述2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-乙酸酯-4′-C-氟代尿苷与氨/甲醇溶液用量比为1mmol:8mL；旋蒸除去溶剂，柱层析得到产物；(5)将步骤(4)得到的产物与4-二甲氨基吡啶、吡啶以及4,4′-二甲氧基三苯甲基氯进行反应，且所述产物与所述4-二甲氨基吡啶、所述吡啶以及4,4′-二甲氧基三苯甲基氯的用量比为1mmol:0.3mmol:8mL:1.3mmol；旋蒸除去溶剂，用二氯甲烷溶解后然后将有机相洗涤、过滤、干燥、柱层析得到2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-氟-5′-O-二甲氧基三苯甲基尿苷；(6)将步骤(5)得到的2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-氟-5′-O-二甲氧基三苯甲基尿苷与二氯甲烷、N,N′-二异丙基乙胺以及2-甲基咪唑进行第四混合，形成第四混合溶液；再将所述第四混合溶液与(2-氰基乙氧基)-N,N′-二异丙基亚磷酰氯进行反应，且所述2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-氟-5′-O-二甲氧基三苯甲基尿苷与所述二氯甲烷、所述N,N′-二异丙基乙胺、...

【专利技术属性】
技术研发人员：周传政，李强，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津,12