一种长期保存过表达VEGF的血管内皮祖细胞的保存液制造技术

本发明专利技术提供了一种长期保存过表达VEGF的血管内皮祖细胞的保存液，包括以下组分：白蛋白、葡萄糖、乙二醇、二甲基亚砜、表皮生长因子、硫酸镁、L‑谷氨酰胺和倍他米松。本发明专利技术还提供了该保存液的使用方法，通过本发明专利技术提供的使用方法，应用该保存液来保存过表达VEGF的血管内皮祖细胞，能够长期保存过表达VEGF的血管内皮祖细胞，并使复苏后的细胞很好地维持增殖功能和血管内皮祖细胞的生物学特性。

A Preservation Solution for Long-term Preservation of Vascular Endothelial Progenitor Cells Overexpressing Vascular Endothelial Growth Factor

The present invention provides a preservation solution for long-term preservation of vascular endothelial progenitor cells overexpressing vascular endothelial growth factor, including the following components: albumin, glucose, ethylene glycol, dimethyl sulfoxide, epidermal growth factor, magnesium sulfate, L glutamine and betamethasone. The invention also provides a method for using the preservation solution. By using the preservation solution, the vascular endothelial progenitor cells overexpressing vascular endothelial progenitor cells can be preserved for a long time, and the resuscitated cells can well maintain the proliferation function and biological characteristics of vascular endothelial progenitor cells.

【技术实现步骤摘要】
一种长期保存过表达VEGF的血管内皮祖细胞的保存液
本专利技术涉及细胞培养领域，具体涉及一种长期保存过表达VEGF的血管内皮祖细胞的保存液。
技术介绍
由于创伤、感染、肿瘤等原因造成的各种类型骨缺损是临床上遇到的常见问题。据美国的最新统计，其每年涉及骨缺损修复的外科手术超过100万人次；而在我国，因交通、工伤和体育运动等导致的意外损伤以每年7.3％的速度递增。近年来，骨组织工程技术的逐渐兴起为骨缺损的修复提供了有效的解决策略，早期研究证明，用组织工程骨修复小段骨缺损时，其早期成骨及后期骨愈合效果明显。但在应用大块组织工程骨修复大段骨缺损时，其核心部位往往发生缺血坏死，导致修复失败，其主要原因就在于未能很好的解决组织工程骨的血管化问题，血管化问题现已成为制约组织工程骨应用于临床的瓶颈。对各种促血管生长因子的研究是目前组织工程骨血管化研究的热点之一。“血管发生”是新生血管形成的主要机制之一，其主要发生于胚胎期，通过内皮前体细胞分化成内皮细胞，在中胚层，内皮细胞分化、增殖、迁移、连接并形成原始毛细血管丛，此过程受血管内皮细胞生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)控制。VEGF是强有力的血管直接诱导因子，是一类具有肝素结合性的二聚糖蛋白，具有诱导血管内皮细胞增殖、促进血管生成、增加毛细血管渗透性等作用，使血管内成分渗漏，为血管内皮细胞迁移及血管形成提供基质，同时抑制血管内皮细胞凋亡，诱导血管平滑肌细胞迁移，促进血管平滑肌细胞合成和分泌基质金属蛋白酶，并加速基质降解及炎症趋化等，最终促使新生毛细血管形成。VEGF家族包括VEGFA、B、C、D和胎盘形成因子，其中VEGFA是研究较集中的因子，具有四种异构体，分别由121、165、189、206个氨基酸组成，其中VEGF-165活性最强，分布范围广，是体内发挥作用的主要形式。然而重组VEGF-165蛋白价格昂贵，在体内会很快被血液、组织液稀释，半衰期短，很难在局部达到持续的有效作用浓度，而且局部大量应用副作用严重，易导致局部血管瘤。血管内皮祖细胞(EndothelialProgenitorCells,EPC)最早由Asahara等于1997年报道，它是一群具有游走特性，尚未表达成熟血管内皮细胞表型，能分化为血管内皮细胞直接参与血管形成。它在骨髓、脐带血及外周血中均存在,并能在出生后的血管新生过程中有很强的促血管生成作用，并以血管发生方式形成新生血管。这一发现，更新了传统意义上的出生后血管生成、血管损伤修复的理论，也为解决组织工程骨血管化问题提供了新的思路。近年来，有关EPCs在成体血管形成中的作用研究主要集中在缺血心肌、缺血肢体、损伤角膜、损伤皮肤的修复等方面，而其在骨组织工程中的研究在国内外则处于刚刚起步阶段。然而由于EPCs的细胞数量有限，获取困难，体外培养时需要扩增，培养周期长，且需要经FN介导贴壁生长才有利于其存活，这些不足限制了其在动物实验及临床研究中的应用。近年来，随着基因工程技术的发展，基因治疗已成为广大学者研究的热点，转基因的组织工程技术为血管化提供了新的思路和方法。VEGF基因修饰EPC可弥补其数量不足的缺点，VEGF基因转染可明显增强EPC的新生血管特性，能大大优化EPC的促血管新生效果。She等报道应用VEGF-165基因转染的EPC能明显促进缺血心肌中血管新生，从而明显改善大鼠急性心肌梗死后的心功能。易成刚等用人脐血中EPC，利用VEGF-165基因体外转染后移植于裸鼠随意皮瓣，可促进缺血皮瓣的血管新生，提高皮瓣的存活率，而转染VEGF-165基因的EPC具有更强大的促血管新生的作用。为了更好地进一步对过表达VEGF的EPC进行研究和应用，其中一个需要解决的问题就是过表达VEGF的EPC的保存问题。常见的动物细胞冷冻保存液是由20％血清培养基和10％二甲亚砜(DMSO)组成的，冷冻保存液可以在降温时减少细胞内冰晶分子的形成，以免对细胞造成伤害，保存时先将含有细胞的冷冻保存液缓慢冷冻，然后在液氮中长期贮存。但是，含血清的保存液成分不明确，不仅含有细胞因子、生长因子、激素等成分，还有未知的成分。专利技术人在研究过程中发现，使用上述常用的冷冻保存液来保存过表达VEGF的内皮祖细胞，会造成解冻复苏后的细胞表达VEGF能力下降，无法很好地保持细胞生物学特性，细胞增殖功能较差等问题。因此，本领域需要一种能够在较长时间内很好地维持过表达VEGF的内皮祖细胞的增殖功能和生物学特性并且组分明确的细胞保存液。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种保存过表达VEGF的内皮祖细胞的保存液，该保存液组分明确，通过使用该保存液，能够长期保存过表达VEGF的内皮祖细胞，并使复苏后的细胞很好地维持增殖功能和内皮祖细胞的生物学特性。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种长期保存过表达VEGF的内皮祖细胞的保存液，包括：白蛋白、葡萄糖、乙二醇、二甲基亚砜、表皮生长因子、硫酸镁、L-谷氨酰胺和倍他米松。优选地，所述的长期保存过表达VEGF的内皮祖细胞的保存液，包括：0.1-20％白蛋白、0.1-10％葡萄糖、0.1-5％乙二醇、5-20％二甲基亚砜、5-15ng/ml表皮生长因子、0.15-0.3g/l硫酸镁、2-5mML-谷氨酰胺和80-100ng/ml倍他米松。在一个优选的实施方案中，所述的长期保存过表达VEGF的内皮祖细胞的保存液，包括：0.5-15％白蛋白、0.5-10％葡萄糖、2-5％乙二醇、5-15％二甲基亚砜、10-15ng/ml表皮生长因子、0.2-0.3g/l硫酸镁、2-5mML-谷氨酰胺和80-100ng/ml倍他米松。在另一个优选的实施方案中，所述的长期保存过表达VEGF的内皮祖细胞的保存液，包括：2-15％白蛋白、1-10％葡萄糖、2-5％乙二醇、5-12％二甲基亚砜、12-15ng/ml表皮生长因子、0.2-0.3g/l硫酸镁、2.5-5mML-谷氨酰胺和80-95ng/ml倍他米松。在再一个优选的实施方案中，所述的长期保存过表达VEGF的内皮祖细胞的保存液，包括：6-15％白蛋白、4-10％葡萄糖、2-5％乙二醇、5-12％二甲基亚砜、12-15ng/ml表皮生长因子、0.2-0.3g/l硫酸镁、2.5-5mML-谷氨酰胺和80-95ng/ml倍他米松。在一个具体的实施方案中，所述的长期保存过表达VEGF的内皮祖细胞的保存液，包括：10％白蛋白、8％葡萄糖、5％乙二醇、10％二甲基亚砜、15ng/ml表皮生长因子、0.25g/l硫酸镁、3mML-谷氨酰胺和80ng/ml倍他米松。本专利技术还提供了一种长期保存过表达VEGF的内皮祖细胞的方法，所述方法包括：(1)取对数生长期的过表达VEGF的血管内皮祖细胞，去除旧的培养基，用PBS清洗；(2)去除PBS，加入适量胰蛋白酶，使其覆盖培养皿表面，将单层生长的细胞消化下来；(3)将步骤(2)所得的细胞液离心，去除上清；(4)向步骤(3)得到的细胞中加入冷冻保存液，轻轻吹打细胞使细胞悬浮均匀，计数并调节冷冻保存液中的细胞浓度为1×106-1×107个/ml；(5)将步骤(4)得到的细胞保存液分装到冻存管中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种长期保存过表达VEGF的内皮祖细胞的保存液，其特征在于包括：白蛋白、葡萄糖、乙二醇、二甲基亚砜、表皮生长因子、硫酸镁、L‑谷氨酰胺和倍他米松，其中，0.1‑20％白蛋白、0.1‑10％葡萄糖、0.1‑5％乙二醇、5‑20％二甲基亚砜、5‑15ng/ml表皮生长因子、0.15‑0.3g/l硫酸镁、2‑5mM L‑谷氨酰胺和80‑100ng/ml倍他米松。

【技术特征摘要】
1.一种长期保存过表达VEGF的内皮祖细胞的保存液，其特征在于包括：白蛋白、葡萄糖、乙二醇、二甲基亚砜、表皮生长因子、硫酸镁、L-谷氨酰胺和倍他米松，其中，0.1-20％白蛋白、0.1-10％葡萄糖、0.1-5％乙二醇、5-20％二甲基亚砜、5-15ng/ml表皮生长因子、0.15-0.3g/l硫酸镁、2-5mML-谷氨酰胺和80-100ng/ml倍他米松。2.按照权利要求1所述的长期保存过表达VEGF的内皮祖细胞的保存液，其特征在于包括：0.5-15％白蛋白、0.5-10％葡萄糖、2-5％乙二醇、5-15％二甲基亚砜、10-15ng/ml表皮生长因子、0.2-0.3g/l硫酸镁、2-5mML-谷氨酰胺和80-100ng/ml倍他米松。3.按照权利要求1所述的长期保存过表达VEGF的内皮祖细胞的保存液，其特征在于包括：10％白蛋白、8％葡萄糖、5％乙二醇、10％二甲基亚砜、15ng/ml表皮生长因子、0.25g/l硫酸镁、3mML-谷氨酰胺和80ng/ml倍他米松。4.按照权利要求1-3任一项所述的长期保存过表达VEGF的内皮祖细胞的保存液的使用方法，其特征在于所述的使用方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐丽婉，吴琨，徐家科，朱思品，
申请(专利权)人：暨赛再生医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44