癌化可能性的评价方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及评价癌化可能性的方法，其具有下述工序：将由正常细胞形成且具备脉管网结构的细胞结构体在来自受检者的生物试样存在下进行培养的培养工序；和将所述培养工序后的所述细胞结构体中的脉管的状态作为指标，评价所述受检者发生癌化的可能性的评价工序；所述生物试样为从所述受检者采集的体液试样、从所述受检者采集的细胞的细胞提取液、或从所述受检者采集的细胞的培养上清液，在所述评价工序中，当与在所述体液试样未存在下进行培养的情况相比，构成所述细胞结构体中的所述脉管的细胞数多时、或者所述细胞结构体中的所述脉管网结构伸长时，评价为所述受检者发生癌化的可能性高。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】癌化可能性的评价方法及试剂盒
本专利技术涉及用于使用由正常细胞形成且具备血管网结构的细胞结构体评价受检者的癌化可能性的方法及试剂盒。本申请主张基于2016年4月19日在日本申请的日本特愿2016-083949号的优先权，其内容援引至本申请。
技术介绍
近年来，正在积极地以液体活检为对象研究癌的早期发现、恶化及转移的预测等的生物标记物。作为液体活检中的代表性的生物标志物，可以举出例如蛋白、核酸(例如ccfDNA、microRNA等)、循环肿瘤细胞(CTCs)、细胞外分泌物囊泡(Exosome，外泌体)等。其中，外泌体作为与以癌为代表的疾病的发病、恶化、发展以及转移等各种情况密切相关的生物标志物，近年来得到广泛研究。外泌体是指在大部分细胞中分泌的直径为40nm～150nm左右的膜囊泡。生物体中，可在唾液、血液、尿、羊水、恶性腹水等体液中观察到，也可从培养细胞分泌。近年来，外泌体被指出有承担向分离的细胞或组织传递信息作用的可能性。外泌体中包括各种蛋白、脂质、核酸，认为通过被搬运到其他细胞而引起功能变化或生理变化。作为其具体例，启示具有介导针对感染性病原体或肿瘤的适应性免疫应答、组织修复、神经传递、病原性蛋白搬运等作用。在最新的研究中，清楚了外泌体中内含的microRNA的亚群根据分泌它们的肿瘤细胞种类的不同而不同。另外，发现了特异性地内包于来自癌患者(胰腺癌)的外泌体内的被称为Glypican1(GPC1)的蛋白，显示外泌体所内含的核酸、蛋白在癌的早期发现、预后诊断及疾病状态监测中传递有益的信息(例如参照非专利文献1)。另外，还报告了外泌体与癌的转移、恶化(血管新生、增殖效率提高)密切相关(例如参照非专利文献2、3、4)。现有技术文献专利文献非专利文献1：SoniaA.m.,etal.,“Glypican-1identifiescancerexosomesanddetectsearlypancreaticcancer”,NATURE,vol.523,p177-182,2015.非专利文献2：AyukoH.,etal.,“Tumourexosomeintegrinsdetermineorganotropicmetastasis”,NATURE,vol.527,p329-335,2015.非专利文献3：HillaryE.m.,etal.,“Extracellularvesicle-mediatedphenotypeswitchinginmalignantandnon-malignantcoloncells”,BMCCancer,15：571,p1-14,2015.非专利文献4：MaraF.R.,etal.,“ExosomesFunctioninPro-andAnti-Angiogenesis”,NIH-PA,2(1),p54-59,2013.
技术实现思路
专利技术所要解决的课题目前作为诊断方法得到应用化研究的方法大部分是对体液中的外泌体所内含的特定的核酸、蛋白的量等进行测量的方法，从外泌体实际地在体内发挥怎样的作用和效果的观点出发，还没有能够进行检查及诊断的技术或方法的报告。本专利技术是鉴于上述情况而完成的，其提供一种用于迅速、简便且更低侵袭性地评价受检者的癌化可能性的方法。用于解决课题的手段本专利技术者们发现了，从癌症患者采集的体液试样等生物试样中含有从癌细胞分泌的有助于癌化的因子，通过研究来自癌症患者或怀疑有癌的患者的生物试样对由正常细胞形成的细胞结构体中的脉管网结构的影响，来评价该患者的癌化可能性的方法，从而完成了本专利技术。本专利技术的第一方式的评价癌化可能性的方法具有下述工序：将由正常细胞形成且具备脉管网结构的细胞结构体在来自受检者的生物试样存在下进行培养的培养工序；和将所述培养工序后的所述细胞结构体中的脉管的状态作为指标，评价所述受检者发生癌化的可能性的评价工序；所述生物试样为从所述受检者采集的体液试样、从所述受检者采集的细胞的细胞提取液、或从所述受检者采集的细胞的培养上清液，在所述评价工序中，当与在所述体液试样未存在下进行培养的情况相比，构成所述细胞结构体中的所述脉管的细胞数多时、或者所述细胞结构体中的所述脉管网结构伸长时，评价为所述受检者发生癌化的可能性高。所述体液试样可以是血液、血清、血浆、尿、白膜、唾液、精液、胸部渗液、脑脊髓液、泪液、痰、粘液、淋巴液、腹水、胸水、羊水、膀胱灌洗液或支气管肺泡灌洗液。所述生物试样可以含有外泌体。所述细胞结构体可以含有选自由血管内皮细胞和淋巴管内皮细胞组成的组中的一种以上。所述细胞结构体可以进一步含有选自由成纤维细胞、神经细胞、树突细胞、巨噬细胞和肥大细胞组成的组中的1种以上。所述细胞结构体可以进一步含有成纤维细胞，所述细胞结构体中的所述血管内皮细胞和所述淋巴细胞的总细胞数可以为所述成纤维细胞的细胞数的0.1％以上。所述细胞结构体的厚度可以为5μm～500μm。构成所述细胞结构体的细胞层的数量可以为2层～60层。在所述培养工序中，可以进行3天～14天的培养。在所述培养工序中，相对于所述正常细胞2×106个的所述外泌体的数量可以为1×103个以上。本专利技术的第二方式的用于评价癌化可能性的试剂盒包含细胞培养容器和在所述细胞培养容器上构建的由正常细胞形成且具备脉管网结构的细胞结构体。专利技术效果根据本专利技术的上述方式，由于能够使用血液等体液试样进行怀疑癌化的受检者发生癌化的可能性的评价，因此能够更低侵袭性地对受检者的癌化进行评价。附图说明图1是表示实施例1中的外泌体添加个数为0个、1×107个、1×108个、1×109个的来自血管网的荧光发光区域及来自外泌体的荧光发光区域的图像。图2(左图)是表示实施例1中的外泌体添加个数为1×109个的细胞结构体的右图所示的荧光发光区域的荧光强度分布的曲线图。(右图)是表示对实施例1中的外泌体添加个数为1×109个的细胞结构体的来自血管网的荧光发光区域和来自外泌体的荧光发光区域的图像。具体实施方式<<用于评价被检者的癌化可能性的方法>>本专利技术的一个实施方式的评价癌化可能性的方法提供具有以下工序的癌化可能性的评价方法：将由正常细胞形成且具备脉管网结构的细胞结构体在来自受检者的生物试样存在下进行培养的培养工序；和将所述培养工序后的所述细胞结构体中的脉管的状态作为指标，评价所述受检者发生癌化的可能性的评价工序。在受检者发生癌症的情况下，来自该受检者的生物试样中含有由癌细胞分泌的microRNA等癌因子。本实施方式的方法中，通过研究生物试样中含有癌因子与否对由正常细胞形成的脉管网结构的影响来进行评价，根据该评价来评价受检者的癌化可能性。通过本实施方式的方法，不一定需要癌组织本身的活检，即使使用可更低侵袭性地采集的体液试样，也能够评价癌化的可能性。另外，由于在癌化可能性的评价中不需要基因分析，因此能够更简便地进行癌化评价。特别是外泌体也被用于癌的早期发现，通过使用本实施方式的方法，能够期待应用于原发性癌或复发性癌的早期发现等诊断技术。通常，“外泌体”是指各种细胞所分泌的直径为40nm～150nm的膜囊泡。已知在该膜囊泡中含有miRNA、mRNA等核酸、蛋白、脂质等。由于从癌细胞分泌的外泌体中含有与癌化相关本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种评价癌化可能性的方法，其具有下述工序：将由正常细胞形成且具备脉管网结构的细胞结构体在来自受检者的生物试样存在下进行培养的培养工序，和将所述培养工序后的所述细胞结构体中的脉管的状态作为指标，评价所述受检者发生癌化的可能性的评价工序；所述生物试样为从所述受检者采集的体液试样、从所述受检者采集的细胞的细胞提取液、或从所述受检者采集的细胞的培养上清液，在所述评价工序中，当与在所述体液试样未存在下进行培养的情况相比，构成所述细胞结构体中的所述脉管的细胞数多时、或者所述细胞结构体中的所述脉管网结构伸长时，评价为所述受检者发生癌化的可能性高。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.04.19 JP 2016-0839491.一种评价癌化可能性的方法，其具有下述工序：将由正常细胞形成且具备脉管网结构的细胞结构体在来自受检者的生物试样存在下进行培养的培养工序，和将所述培养工序后的所述细胞结构体中的脉管的状态作为指标，评价所述受检者发生癌化的可能性的评价工序；所述生物试样为从所述受检者采集的体液试样、从所述受检者采集的细胞的细胞提取液、或从所述受检者采集的细胞的培养上清液，在所述评价工序中，当与在所述体液试样未存在下进行培养的情况相比，构成所述细胞结构体中的所述脉管的细胞数多时、或者所述细胞结构体中的所述脉管网结构伸长时，评价为所述受检者发生癌化的可能性高。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述体液试样是血液、血清、血浆、尿、白膜、唾液、精液、胸部渗液、脑脊髓液、泪液、痰、粘液、淋巴液、腹水、胸水、羊水、膀胱灌洗液或支气管肺泡灌洗液。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述生物试样含有外泌体。4.根据权利要求1～3中任一项所...

【专利技术属性】
技术研发人员：塚本圭，北野史朗，入江新司，
申请(专利权)人：凸版印刷株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP