用于蛋白生产和文库产生的哺乳动物细胞系制造技术

根据本发明专利技术的第一方面，提供了产生细胞系的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供多个哺乳动物B细胞，其中所述多个B细胞中的每一个包含编码标志物蛋白的转基因基因组DNA序列，所述标志物蛋白插入到包含在所述B细胞中的内源性免疫球蛋白基因座中，并且其中所述转基因基因组DNA序列适合于被定点核酸酶、特别是Cas9切割；(b)用编码目标蛋白的第二转基因DNA序列替换编码标志物蛋白的转基因基因组DNA序列；(c)基于标志物蛋白的存在或不存在来分选B细胞；和(d)收集其中不存在标志物蛋白的B细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于蛋白生产和文库产生的哺乳动物细胞系本专利技术涉及工程化细胞系及其用于快速产生用于蛋白表达的稳定细胞和产生用于定向进化和蛋白工程的蛋白文库的用途。
技术介绍
目前可用的用于从哺乳动物细胞产生蛋白的方法主要依赖于三种细胞系中的随机转基因整合：人胚胎肾293(HEK293)细胞、小鼠骨髓瘤细胞(Sp20和NS0)和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。这些方法既昂贵又耗时。用于治疗性蛋白生产的生物技术工业标准要求产生稳定的重组蛋白生产细胞系，当从冷冻的细胞储备恢复时，其能够几乎无限地生产蛋白。通过定向进化工程化蛋白需要通过体外诱变方法(例如，易错PCR、简并引物PCR诱变、DNA改组(DNAshuffling)，然后克隆到表达宿主中并高通量筛选。可在哺乳动物细胞中产生的文库的大小由于差的转染效率而受到限制。因此，蛋白文库的高通量筛选通常采用正交表面展示平台，主要基于体外或微生物表达(例如，核糖体、噬菌体、酵母及细菌展示)。与哺乳动物细胞相比，这些宿主可能对蛋白折叠、糖基化模式和表达具有大的影响。然而，关键的是，标准系统不能有效地表达和筛选一些复杂的蛋白(例如，全长抗体)。另外，在治疗性蛋白的情况下，在体外或微生物系统中的文库筛选之后，经常需要将基因亚克隆到哺乳动物表达系统中以进行适当的表征。本专利技术的基础问题是提供用于产生稳定哺乳动物细胞系的快速、可靠和廉价的方法，其可用于重组蛋白表达以及用于产生和筛选用于蛋白工程和定向进化应用的大蛋白文库。该问题通过独立权利要求的主题来解决。定义在本说明书的上下文中，术语“序列同一性”和“序列同一性百分比”是指通过比较两个对齐的序列而确定的值。用于比较的序列比对方法是本领域公知的。用于比较的序列的比对可如下进行：通过Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的全局对齐算法，通过Pearson和Lipman,Proc.Nat.Acad.Sci.85:2444(1988)的相似性检索方法，或通过这些算法的计算机化实施方式，包括但不限于：CLUSTAL、GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。用于执行BLAST分析的软件可公开获取，例如通过美国国家生物技术信息中心(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)。用于比较氨基酸序列的一个实例是BLASTP算法，其使用默认设置：预期阈值：10；字数：3；查询范围内的最大匹配：0；矩阵：BLOSUM62；空位成本：存在11，延伸1；合成调整：条件合成得分矩阵调整。用于比较核酸序列的一个这样的实例是BLASTN算法，其使用默认设置的：预期阈值：10；字数：28；查询范围内的最大匹配：0；匹配/错配得分：1.-2；空位成本：线性。除非另有说明，本文提供的序列同一性值是指分别使用用于蛋白和核酸比较的上述确定的默认参数，使用BLAST程序套件(Altschul等，J.Mol.Bio.215:403-410(1990))获得的值。在本说明书的上下文中，术语"B细胞"是指已经通过V(D)J重组完成免疫球蛋白重链和轻链基因座的基因组重排的淋巴系细胞。在本说明书的上下文中，术语"IgH基因座"指免疫球蛋白重链基因的基因座。在本说明书的上下文中，术语"位点定向核酸内切酶"是指选自包括CRISPR相关核酸内切酶、锌指核酸酶(ZFN)、基于转录激活子样效应子的核酸酶(TALEN)和兆核酸酶(meganuclease)的组的核酸内切酶。在本说明书的上下文中，术语"CRISPR相关核酸内切酶(Cas9)"指酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)的Cas9核酸内切酶(SpyCas9)、SpyCas9的直系同源物或者SpyCas9的工程化蛋白变体或其直系同源物。在本说明书的上下文中，术语"直系同源物(orthologue)"是指通过来自单个祖先基因的垂直继嗣进化的基因及其相应多肽。换句话说，直系同源基因/多肽共有一个共同的祖先，并且当一个物种分裂成两个独立的物种时被分开。然后将两个所产生的物种中的单个基因的拷贝称为直系同源物。为了确定两个基因是直系同源物，本领域技术人员可以通过比较所比对对齐的基因或多肽的核苷酸或氨基酸序列来进行基因谱系的系统发育分析。在本说明书的上下文中，术语“抗体”以其在细胞生物学和免疫学领域中已知的含义使用；它是指全抗体，包括但不限于免疫球蛋白G型(IgG)、A型(IgA)、D型(IgD)、E型(IgE)或M型(IgM)、其任何抗原结合片段或单链及其相关或衍生的构建体。全抗体是包含通过二硫键相互连接的至少两个重链(H)和两个轻链(L)的糖蛋白。每个重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每个轻链包括轻链可变区(此处缩写为VL)和轻链恒定区(CL)。轻链恒定区由一个结构域CL组成。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分。本说明书上下文中的术语“抗体样分子”是指能够以高亲和力(Kd≤10E-8mol/l)特异性结合另一分子或靶标的分子。类似于抗体的特异性结合，抗体样分子与其靶标结合。术语抗体样分子包括重复蛋白，例如设计的锚蛋白重复蛋白(MolecularPartners，Zürich)、源自犰狳重复蛋白的多肽、源自富亮氨酸重复蛋白的多肽和源自三角形四肽(tetratricopeptide)重复蛋白的多肽。术语“抗体样分子”还包括衍生自蛋白A结构域的多肽(蛋白A结构域衍生多肽)、衍生自纤连蛋白结构域FN3的多肽、衍生自共有纤连蛋白结构域的多肽、衍生自脂质运载蛋白的多肽、衍生自锌指的多肽、衍生自Src同源结构域2(SH2)的多肽、衍生自Src同源结构域3(SH3)的多肽、衍生自PDZ结构域的多肽、衍生自γ-晶状体蛋白的多肽、衍生自泛素的多肽、衍生自半胱氨酸结多肽的多肽以及衍生自打结素(knottin)的多肽。术语“蛋白A结构域衍生多肽”是指作为蛋白A的衍生物并且能够特异性结合免疫球蛋白的Fc区和Fab区的分子。术语“犰狳重复蛋白”是指包含至少一个犰狳重复序列的多肽，其中犰狳重复序列的特征在于形成发夹结构的一对α螺旋。在本说明书的上下文中，术语“人源化骆驼抗体(camelidantibody)”是指仅由重链或重链的可变结构域(VHH结构域)组成的抗体，其氨基酸序列已被修饰以增加其与在人中天然产生的抗体的相似性，并因此当被施用于人类时显示降低的免疫原性。Vincke等"Generalstrategytohumanizeacamelidsingle-domainantibodyandidentificationofauniversalhumanizednanobodyscaffold"，JBiolChem.2009年1月30日；284(5):3273-3284和US2011165621A1中显示了人源化骆驼抗体的一般策略。在本说明书的上下文中，术语“可结晶片段本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于产生细胞系的方法，其包括以下步骤：a.提供多个哺乳动物B细胞，其中所述多个B细胞中的每一个包含编码标志物蛋白的转基因基因组DNA序列，其中所述转基因基因组DNA序列插入到包含在所述B细胞中的内源性免疫球蛋白基因座，特别是IgH基因座中，并且其中所述转基因基因组DNA序列适合于被定点核酸酶、特别是CRISPR‑相关核酸内切酶(Cas9)切割；b.用编码目标蛋白的第二转基因DNA序列替换编码所述标志物蛋白的所述转基因基因组DNA序列；c.基于所述标志物蛋白的存在或不存在来分选所述B细胞；和d.收集其中不存在所述标志物蛋白的B细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.04.04 EP 16163734.31.一种用于产生细胞系的方法，其包括以下步骤：a.提供多个哺乳动物B细胞，其中所述多个B细胞中的每一个包含编码标志物蛋白的转基因基因组DNA序列，其中所述转基因基因组DNA序列插入到包含在所述B细胞中的内源性免疫球蛋白基因座，特别是IgH基因座中，并且其中所述转基因基因组DNA序列适合于被定点核酸酶、特别是CRISPR-相关核酸内切酶(Cas9)切割；b.用编码目标蛋白的第二转基因DNA序列替换编码所述标志物蛋白的所述转基因基因组DNA序列；c.基于所述标志物蛋白的存在或不存在来分选所述B细胞；和d.收集其中不存在所述标志物蛋白的B细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多种B细胞选自包含原代B细胞、永生化B细胞、杂交瘤细胞、骨髓瘤细胞、浆细胞瘤细胞和淋巴瘤细胞的组。3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述标志物蛋白和/或所述目标蛋白在内源性免疫球蛋白启动子、特别是VH启动子的控制下表达。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述多个B细胞中的每一个中，内源性VH基因和内源性VL基因被破坏。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多个B细胞经遗传修饰以组成型表达所述CRISPR相关核酸内切酶(Cas9)。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多个B细胞经遗传修饰而以可诱导和可滴定的方式表达活化诱导的胞苷脱氨酶(AID)。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多个B细胞包含安全港基因座，并且其中包含编码所述CRISPR相关核酸内切酶的DNA序列的第一表达盒插入到所述安全港基因座中。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多个B细胞包含安全港基因座，并且其中包含编码所述活化诱导胞苷脱氨酶(AID)的DNA序列的第二表达盒插入到所述安全港基因座中。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过Cas9介导的位点定向DNA切割，和随后通过同源定向修复(HDR)或非同源末端连接(NHEJ)进行的所述第二转基因DNA序列的整合，从而介导所述转基因基因组DNA序列的所...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·雷迪，W·凯尔顿，C·帕罗拉，D·梅森，M·博格森，
申请(专利权)人：苏黎世联邦理工学院，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH