作为糖苷合酶的Endo-S2突变体、制备方法以及用于糖蛋白的糖工程化的用途技术

本发明专利技术提供了重组Endo‑S2突变体(被命名为Endo‑S2糖苷合酶)，其表现出降低的水解活性和增加的转糖基活性以用于合成糖蛋白，其中将所期望的糖链添加到岩藻糖基化或非岩藻糖基化的GlcNAc‑IgG受体。因而，本发明专利技术允许合成和重塑治疗性抗体，从而提供某些生物活性，如延长的体内半衰期、更小的免疫原性、增强的体内活性、提高的靶向能力、和/或递送治疗剂的能力。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】作为糖苷合酶的Endo-S2突变体、制备方法以及用于糖蛋白的糖工程化的用途政府在本专利技术中的权利本专利技术是在政府支持下在由国家卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)授予的基金号R01GM096973和R01GM080374下作出的。政府享有本专利技术的某些权利。相关申请的交叉引用本申请要求2016年1月15日提交的共同未决的美国临时申请号62/279,087的优先权，该申请的内容在此通过引用并入本文用于所有目的。
本专利技术涉及糖蛋白合成，并且更具体来说，涉及重组突变体EndoS2的用途，它是来自化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)的血清型M49的菌株NZ131的内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶，具有转糖基活性和有限的水解活性，从而提供抗体的有效糖基化重塑。
技术介绍
单克隆抗体(mAb)代表用于治疗癌症、炎症性病症、以及感染性疾病的一类主要的治疗性蛋白质[1-3]。令人信服的实验数据已经显示，糖基化对抗体的稳定性、生物功能、以及总体治疗功效可以具有深远的影响[4-7]。举例来说，Fc聚糖的核心岩藻糖基化可以显著降低抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，并且具有低含量的核心岩藻糖基化的抗体已经在抗癌治疗中显示出提高的治疗功效[8,9]。另一方面，据报道，末端α-2,6-唾液酸化Fc糖型是静脉注射免疫球蛋白(IVIG)中的一种次要组分，负责IVIG的抗炎活性，如在动物模型中所证实[10-13]。然而，天然抗体和重组抗体通常作为异质糖型产生，所述异质糖型难以分离以进一步探测抗体的结构-活性关系。此外，对于市场上依靠ADCC作为治疗功效的主要机制的大部分抗癌mAb，最具活性的非岩藻糖基化糖型通常作为异质混合物中的少部分存在[8,9]。因此，可以引起产生结构明确、均质糖型的抗体的方法对于功能研究和开发更好的基于抗体的治疗剂来说是非常期望的。在尝试经由宿主糖基化途径工程化来控制糖基化[14-20]同时，一种化学酶促糖基化重塑方法已经作为获得均质抗体糖型的一种有前景的方法出现，所述方法包括完整抗体的内切糖苷酶催化的脱糖基化和后续的转糖基[21]。已显示，重组IgG-Fc结构域的Fc聚糖可以在适当的内切糖苷酶包括Endo-A和Endo-D催化下通过酶促脱糖基化-转糖基步骤来重塑，而不需要使蛋白质变性[22-24]。在2012年，出现了完整治疗性单克隆抗体和IVIG的糖基化重塑的第一个实例，这通过发现Endo-S的糖苷合酶突变体而得以实现，所述Endo-S是一种来自化脓性链球菌的内切糖苷酶[25]。在这种方法中，诸如利妥昔单抗(rituximab)的单克隆抗体的异质Fc聚糖由EndoS催化的脱糖基化去除以产生在糖基化位点处仅携带α-1,6-岩藻糖基化GlcNAc受体的抗体蛋白骨架。然后，通过Endo-S糖苷合酶突变体(EndoS-D233A或D233Q)以位点特异性和立体特异性方式将期望的N-聚糖转移到GlcNAc受体以重构均质糖型的抗体。Endo-S糖苷合酶突变体已经由几个研究小组用来合成抗体的不同均质糖型以用于结构和功能研究[26-31]。虽然Endo-S糖苷合酶能够转移双分支复杂型和修饰的Man3GlcNAc核心，但是这些突变体在转移高甘露糖型N-聚糖方面仅显示出很低的活性。最近，已经产生来自Endo-F3的糖苷合酶突变体，这是另一种GH18家族内切糖苷酶[32]。发现Endo-F3糖苷合酶如D165A突变体能够将三分支N-聚糖转移到完整抗体的Fc结构域，但是它们需要α1,6-岩藻糖基化GlcNAc部分作为转糖基的受体并且不能转移到非岩藻糖基化的GlcNAc受体。这些研究已经证实，迄今为止可获得的糖苷合酶仍然由于底物特异性而具有限制并且在转糖基效率方面也不同。通过了解其他突变体的缺点，本文描述了扩大糖基化重塑策略的范围的努力，其中注意力转向来自血清型M49的化脓性链球菌的内切糖苷酶Endo-S2[33,34]。Endo-S2与来自相同细菌的Endo-S仅显示37％的序列同一性，并且在Fc脱糖基化中显示出比Endo-S更宽的聚糖底物特异性[34]。数据暗示与Endo-S相比，野生型Endo-S2可以水解来自抗体Fc结构域的各种不同类型的N-聚糖。但是，尚不清楚Endo-S2是否具有转糖基活性并且如果是的话，是否可以通过定点诱变产生Endo-S2糖苷合酶。因此，将有利的是，评价是否可以从Endo-S2产生有效的糖苷合酶以及它们是否可能会在转糖基中具有与先前所报道的那些相比更宽的底物特异性。
技术实现思路
本专利技术提供了重组Endo-S2突变体(被命名为Endo-S2糖苷合酶)，其表现出降低的水解活性和增加的转糖基活性以用于合成糖蛋白，其中将所期望的糖链添加到岩藻糖基化或非岩藻糖基化的GlcNAc-IgG受体中。因而，本专利技术允许合成和重塑治疗性抗体，从而提供某些生物活性，如延长的体内半衰期、更小的免疫原性、增强的体内活性、提高的靶向能力、和/或递送治疗剂的能力。本专利技术的突变体Endo-S2糖苷合酶使得能够对治疗性抗体和其Fc片段进行糖基化重塑而增加不同聚糖如高甘露糖型和杂合型聚糖的数量，这是无法通过先前公开的Endo-S突变体实现的。在一个方面，本专利技术提供了化脓性链球菌的血清型M49的菌株NZ131的内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶(Endo-S2)(SEQIDNO:1)的突变体的转糖基活性，其中所述突变体与其具有至少85％同源性并且对岩藻糖基化和非岩藻糖基化的GlcNAc-IgG受体都表现出转糖基活性，其中所述内切糖苷酶使得能够将低聚糖(呈活化的糖唑啉的形式)整体转移到岩藻糖基化或非岩藻糖基化的GlcNAc-IgG以形成IgG的新的糖型。在另一个方面，本专利技术提供了Endo-S2突变体蛋白，其相对于野生型EndoS2显示出显著提高的转糖基效率和减弱或消除的产物水解活性。突变体优选地包括位点特异性突变，包括Asp-184处的突变。所述突变体蛋白包括但不限于D184A(SEQIDNO:2)、D184N(SEQIDNO:3)、D184Q(SEQIDNO:4)、D184R(SEQIDNO:5)、D184C(SEQIDNO:6)、D184M(SEQIDNO:7)、D184E(SEQIDNO:8)、D184G(SEQIDNO:9)、D184H(SEQIDNO:10)、D184I(SEQIDNO:11)、D184L(SEQIDNO:12)、D184K(SEQIDNO:13)、D184F(SEQIDNO:14)、D184P(SEQIDNO:15)、D184S(SEQIDNO:16)、D184T(SEQIDNO.17)、D184W(SEQIDNO:18)、D184Y(SEQIDNO:19)、D184V(SEQIDNO:20)或其片段，所述突变体蛋白包括催化结构域并且相对于野生型Endo-S2蛋白表现出增加的转糖基作用和降低的水解作用。优选地，所述突变体蛋白包括D184M(SEQIDNO:7)、D184E(SEQIDNO:8)以及D184Q(SEQIDNO:4)。值得注意的是，在D184位点处携带突变的任何Endo-S2片段和结构域都包括在本专利技术中，其中任何这样的结构域和片段可以与其他蛋白质融合，所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备具有预定的低聚糖部分的岩藻糖基化或非岩藻糖基化的糖蛋白的方法，所述方法包括：提供岩藻糖基化或非岩藻糖基化的受体蛋白，所述岩藻糖基化或非岩藻糖基化的受体蛋白包括岩藻糖基化的GlcNAc‑蛋白或非岩藻糖基化的GlcNAc‑蛋白；以及使用化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)(血清型M49)内切糖苷酶‑S2 Asp184突变体酶或其片段使所述岩藻糖基化或非岩藻糖基化的GlcNAc受体发生酶促反应，所述突变体酶或其片段包括催化结构域并且相对于野生型Endo‑S2酶表现出增加的转糖基活性和降低的水解活性，其中活化的低聚糖供体携带包含预定数量和类型的糖残基的低聚糖部分，其中经由酶促反应，所述活化的低聚糖部分与所述岩藻糖基化或非岩藻糖基化的GlcNAc受体共价连接，从而制备所述具有预定的低聚糖部分的岩藻糖基化或非岩藻糖基化的糖蛋白。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.01.15 US 62/279,0871.一种制备具有预定的低聚糖部分的岩藻糖基化或非岩藻糖基化的糖蛋白的方法，所述方法包括：提供岩藻糖基化或非岩藻糖基化的受体蛋白，所述岩藻糖基化或非岩藻糖基化的受体蛋白包括岩藻糖基化的GlcNAc-蛋白或非岩藻糖基化的GlcNAc-蛋白；以及使用化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)(血清型M49)内切糖苷酶-S2Asp184突变体酶或其片段使所述岩藻糖基化或非岩藻糖基化的GlcNAc受体发生酶促反应，所述突变体酶或其片段包括催化结构域并且相对于野生型Endo-S2酶表现出增加的转糖基活性和降低的水解活性，其中活化的低聚糖供体携带包含预定数量和类型的糖残基的低聚糖部分，其中经由酶促反应，所述活化的低聚糖部分与所述岩藻糖基化或非岩藻糖基化的GlcNAc受体共价连接，从而制备所述具有预定的低聚糖部分的岩藻糖基化或非岩藻糖基化的糖蛋白。2.权利要求1的方法，其中所述岩藻糖基化或非岩藻糖基化的受体蛋白是抗体或其含有Fc的片段。3.权利要求1或2任一项的方法，其中所述活化的低聚糖组分是合成低聚糖唑啉或天然N-聚糖(复杂、高甘露糖、或杂合)唑啉。4.前述权利要求任一项的方法，其中所述合成低聚糖唑啉是二糖唑啉、三糖唑啉、四糖唑啉、五糖唑啉、六糖唑啉、七糖唑啉、八糖唑啉、九糖唑啉、十糖唑啉或十一糖唑啉。5.前述权利要求任一项的方法，其中所述活化的低聚糖组分还包含另外的生物活性剂或标签。6.权利要求5的方法，其中所述另外的生物活性剂或标签是药物、毒素、荧光探针、生物素、PEG、脂质、或多肽。7.前述权利要求任一项的方法，其中所述岩藻糖基化的受体蛋白是α-1-6-岩藻糖基-GlcNAc-蛋白。8.前述权利要求任一项的方法，其中所述岩藻糖基化或非岩藻糖基化的糖蛋白是选自以下的单克隆抗体：17b、48d、A32、C11、2G12、F240、IgG1b12、19e、X5、TNX-355、西妥昔单抗、利妥昔单抗、莫罗单抗-CD3、阿昔单抗、达利珠单抗、巴利昔单抗、帕利珠单抗、英夫利昔单抗、曲妥珠单抗、吉妥珠单抗奥唑米星、阿仑单抗、替伊莫单抗、阿达木单抗、奥马珠单抗、托西莫单抗、I-131托西莫单抗、依法利珠单抗、贝伐单抗、帕尼单抗、帕妥珠单抗、那他珠单抗、依那西普、IGN101、伏洛昔单抗、抗CD80mAb、抗CD23mAb、CAT-3888、CDP-791、艾拉普妥珠单抗、MDX-010、MDX-060、MDX-070、马妥珠单抗、CP-675,206、CAL、SGN-30、扎木单抗、阿德木单抗、奥戈伏单抗、尼妥珠单抗、ABT-874、地诺单抗、AM108、AMG714、芳妥珠单抗、达利珠单抗、戈利木单抗、CNTO1275、奥瑞珠单抗、HuMax-CD20、贝利单抗、依帕珠单抗、MLN1202、维西珠单抗、托珠单抗、奥克尔利珠单抗、聚乙二醇化赛妥珠单抗、依库珠单抗、培克珠单抗、阿昔单抗、兰尼子木单抗、美泊利单抗以及MYO-029。9.权利要求2的方法，其中所述抗体还包含选自以下的另外的部分：用于治疗癌症的治疗剂、用于HIV的治疗剂；毒素、对另外的受体具有反应性的与所述修饰的抗体不同的抗体、抗原、趋化因子以及细胞因子。10.前述权利要求任一项的方法，其中所述内切糖苷酶-S2突变体选自包含以下各项的突变体文库：D184A(SEQIDNO:2)、D184N(SEQIDNO:3)、D184Q(SEQIDNO:4)、D184R(SEQIDNO:5)、D184C(SEQIDNO:6)、D184M(SEQIDNO:7)、D184E(SEQIDNO:8)、D184G(SEQIDNO:9)、D184H(SEQIDNO:10)、D184I(SEQIDNO:11)、D184L(SEQIDNO:12)、D184K(SEQIDNO:13)、D184F(SEQIDNO:14)、D184P(SEQIDNO:15)、D184S(SEQIDNO:16)、D184T(SEQIDNO.17)、D184W(SEQIDNO:18)、D184Y(SEQIDNO:19)、D184V(SEQIDNO:20)或其片段，所述内切糖苷酶-S2突变体包括催化结构域并且相对于所述野生型Endo-S2蛋白表现出增加的转糖基作用和降低的水解作用。11.前述权利要求任一项的方法，其中所述内切糖苷酶-S2突变体是D184M(SEQIDNO:7)、D184E(SEQIDNO:8)或D184Q(SEQIDNO:4)。12.一种合成均质的岩藻糖基化或非岩藻糖基化的糖蛋白的方法，所述方法包括：(a)提供天然糖蛋白或重组糖蛋白；(b)通过选自Endo-H、Endo-F3、EndoS、或Endo-A的酶去除异质或不期望的N-聚糖以形成均质的含有岩藻糖基化或非岩藻糖基化的GlcNAc的蛋白；(c)提供含有唑啉的低聚糖，所述低聚糖具有所期望的低聚糖组分，所述低聚糖组分包含具有限定数量和类...

【专利技术属性】
技术研发人员：王来曦，杨强，李铁正，童新，
申请(专利权)人：马里兰大学帕克分校，
类型：发明
国别省市：美国,US