用于小鼠卫星细胞增殖的小分子制造技术

本发明专利技术提供了用于诱导、增强或增加卫星细胞增殖的方法和用于筛选用来诱导、增强或增加卫星细胞增殖的候选化合物的测定法。还提供了用于修复对象的受损肌肉组织或使其再生的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于小鼠卫星细胞增殖的小分子相关申请本申请是2016年2月1日提交的美国专利申请系列号15/012,656的部分连续案并要求其优先权，后者是2014年6月13日提交的美国专利申请系列号14/126,716(现在的美国专利号9,248,185，2016年2月2日颁发)的部分连续案并要求其优先权，后者是2012年6月18日提交的国际申请号PCT/US2012/042964在35U.S.C.371下的国家阶段申请，后者在35U.S.C.§119(e)下要求2011年6月16日提交的美国临时申请号61/497,708的权益，这些文献的内容整体通过引用并入本文。
本公开总的来说涉及促进卫星细胞增殖的组合物和方法。
技术介绍
卫星细胞是位于围绕肌纤维的基底层下方并为损伤或锻炼后肌肉生长和肌肉修复所需的骨骼肌干细胞群体。卫星细胞的数目和功能受到正常衰老影响，并且在几种疾病中，引起渐进性肌肉消耗(wasting)或损伤后恢复低效。实例包括杜氏肌营养不良症，其中卫星细胞通过经常使用而被耗尽，以及肌肉减少症，其中卫星细胞可能既被耗尽，也在它们的增殖能力上受到它们的环境变化的不利影响(Jejurikar和Kuzon，Apoptosis,8(2003),573-578)。扩增卫星细胞的内源群体的发现性治疗方法可以极大地帮助治疗这些衰竭性疾病。因此，在本领域中，对诱导卫星细胞增殖的组合物和方法，存在着需求。专利技术概述本专利技术人进行了所选小分子的基于图像的筛查，以发现它们增加从成年小鼠肌肉组织分离的卫星细胞的增殖的能力。卫星细胞使用细胞表面标志物来分离(Sherwood等，Cell,119(2004),543-554)，在小分子存在下培养4天，然后使用自动共聚焦显微术进行分析，以确定细胞数目。使用这种程序，本专利技术人发现了几种通过确定的信号通路运作的化合物，其可以在原代小鼠卫星细胞的培养物中增强增殖。目前正通过标志物分析和分化测定法以及体内肌肉移植来测试处理过的细胞的生肌能力。所述化合物能够增殖细胞而对它们的分化潜力没有不利影响，并且可用于治疗具有骨骼肌缺陷作为其组成之一的疾病。这些化合物在本文中也被称为增殖增强剂。因此，本文提出了一种诱导、增强或增加卫星细胞增殖的方法。所述方法包括将卫星细胞与选自激酶抑制剂、G蛋白偶联受体(GPCR)调节剂、表观遗传修饰剂、组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)调节剂、hedgehog信号通路调节剂、神经肽、多巴胺受体调节剂、血清素受体调节剂、组胺受体调节剂、腺苷受体激动剂、离子载体、离子通道调节剂、γ-分泌酶调节剂、皮质甾类及其任何组合的化合物相接触。所述待接触的卫星细胞可以在体外、离体或体内。另一方面，本文提供了一种用于修复对象的受损肌肉组织或使其再生的方法。所述方法包括向所述对象给药治疗有效量的选自激酶抑制剂、G蛋白偶联受体(GPCR)调节剂、表观遗传修饰剂、组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)调节剂、hedgehog信号通路调节剂、神经肽、多巴胺受体调节剂、血清素受体调节剂、组胺受体调节剂、离子载体、离子通道调节剂、γ-分泌酶调节剂及其任何组合的化合物。另一方面，本文提供了一种筛选用于诱导、增强或增加卫星细胞增殖的候选化合物的方法。所述方法包括：(a)将卫星细胞群体与测试化合物相接触；(b)评估卫星细胞的增殖；以及(c)选择诱导、增加或增强卫星细胞增殖的化合物。附图简述该专利或申请文件含有至少一张彩图。本专利或专利申请公开的带有彩图的拷贝，在提出请求并支付必要的费用之后，由专利办公室提供。图1A-1C示出了卫星细胞数目的Opera分析。图像使用PerkinElmerOpera自动共聚焦成像系统来捕获。由于从CAG-EGFP动物分离的所有细胞都产荧光，因此本专利技术人可以将细胞直接成像(图1A)。图像使用Acapella软件进行分析，以计数对于每种参数来说信号在设定阈值之内的细胞(图1B)。过于暗淡(箭头)或过小(无尾箭头)的细胞或碎片被排除。荧光高或尺寸过大的细胞和碎片也被排除。然后可以将细胞按照设定的标准例如圆度进一步分组(图1C)。图2A-2D示出了阳性命中化合物的分析。成年小鼠卫星细胞在Sherwood等(Cell,119(2004),543-554)概括的程序的基础上，通过FACS来分离。然后，将细胞用化合物处理并允许其增殖4天，固定并成像。将由化合物诱导的增殖与使用DMSO介质对照发现的增殖(图2A)或与使用bFGF发现的增殖(图2B)进行比较。示出了来自于阳性命中化合物的两张示例性图像，Flt3激酶抑制剂(图2C)和腺苷受体激动剂(图2D)。图3A和3B显示了一些示例性命中化合物的验证。将在初筛中鉴定为命中物的化合物随后在剂量响应测定法中测试。增殖水平被测量为与DMSO介质对照值(A.1±0.3(图3A)和1±0.4(图3B))相比的倍数变化。作为比较，bFGF阳性对照值为3.4±0.9(图3A)和5.6±1.7(图3B)。图4示出了培养条件的优化。通过在存在或不存在bFGF的情况下测试不同暴露时间下化合物的效果来优化培养条件。对于所有时间点来说，在所指示的日子将培养基用标准的增殖培养基替换。对于这种化合物来说，包含bFGF对于增殖具有累加效果。此外，尽管在所有时间点所述化合物自身引起与bFGF阳性对照类似的增殖，但可以看到它在使用较短暴露时间时更加有效。图5A-5C示出了处理过的培养物的分化。CAG-EGFP卫星细胞在本专利技术人的标准增殖条件下生长并暴露于化合物4天。在本专利技术人的标准增殖条件下，将细胞在层粘连蛋白包被的板上，在增补有10％热失活的马血清、100单位/mL的青霉素/100ug/mL的链霉素和2mML-谷氨酰胺的Ham'sF-10培养基中培养。在铺板后的当天添加化合物。化合物和培养基每日或在3日后更新。为了使细胞分化并形成肌管，在增殖条件下4天后，将培养基切换为增补有10％热失活的马血清、10％胎牛血清、0.5％鸡胚胎提取物、100单位/mL的青霉素/100ug/mL的链霉素和2mML-谷氨酰胺的高葡萄糖DMEM。将培养物在分化培养基中生长3-5日，直至观察到肌管形成，然后固定。然后将培养物切换到分化培养基中并继续培养4天。然后将它们固定并用抗肌球蛋白重链抗体(红色通道)和Hoechst(蓝色通道)染色。仅使用DMSO介质对照生长的细胞由于在培养物中不够浓密而没有形成肌管(数据未示出)。在bFGF阳性对照存在下生长的细胞(图5A)能够形成大的肌管。在Flt3激酶抑制剂(图5B)和腺苷激动剂(图5C)存在下生长的培养物也能够形成肌管。图6示出了用CEP/DMSO处理5天的单一SMP的生肌集落形成。处理间隔d1-d3.5，并且n＝3。图7示出了从d2至d4.5向化合物的暴露。初始细胞数目为250，并且n＝3。图8A和8B示出了5天后CXCR4和β-1整合蛋白在培养的SMP上的表达：CEP(图8A)和DMSO(图8B)。图9A-13示出了一些示例性命中化合物的剂量响应曲线。示出的是舒尼替尼(SU11248，图9A和9B)、Jak3抑制剂VI(图10A和10B)、来他替尼(CEP701，图11A和11B)、博舒替尼(图12)和SU11652(图13)。图14-17是示出了bFGF本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种增加卫星细胞增殖的方法，所述方法包括：将卫星细胞与选自激酶抑制剂、G蛋白偶联受体(GPCR)调节剂、组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)调节剂、表观遗传修饰剂、hedgehog信号通路调节剂、神经肽、多巴胺受体调节剂、血清素受体调节剂、组胺受体调节剂、腺苷受体激动剂、离子载体、离子通道调节剂、γ‑分泌酶调节剂、皮质甾类及其任何组合的化合物相接触。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.02.01 US 15/012,6561.一种增加卫星细胞增殖的方法，所述方法包括：将卫星细胞与选自激酶抑制剂、G蛋白偶联受体(GPCR)调节剂、组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)调节剂、表观遗传修饰剂、hedgehog信号通路调节剂、神经肽、多巴胺受体调节剂、血清素受体调节剂、组胺受体调节剂、腺苷受体激动剂、离子载体、离子通道调节剂、γ-分泌酶调节剂、皮质甾类及其任何组合的化合物相接触。2.权利要求1的方法，其中所述化合物选自小的有机或无机分子、糖精、寡糖、多糖、肽、蛋白质、肽类似物和衍生物、抗体、抗体片段、肽模拟物、核酸、核酸类似物和衍生物、从生物材料制备的提取物、天然存在或合成的组合物及其任何组合。3.权利要求1-2任一项的方法，其中所述化合物是B-Raf抑制剂、JAK3抑制剂、p38MAPK抑制剂、C-Raf1抑制剂、Akt抑制剂、ERK抑制剂、BMK1/ERK5抑制剂、p38MAPK抑制剂、RTK抑制剂、ERK5抑制剂、Bcr-Abl抑制剂、RhoK抑制剂、p38抑制剂、p110抑制剂、FAK抑制剂、ATP竞争性JNK抑制剂、MELK抑制剂、表5中鉴定到的通路的抑制剂、Flt3激酶抑制剂、PDGFR/EGFR抑制剂、Bcr-abl抑制剂、Jak3抑制剂、SRC激酶抑制剂、HDAC1修饰剂、HDA31修饰剂、HDAC6修饰剂、BRD2修饰剂、BRD2修饰剂、EGLN1修饰剂、或其衍生物、盐、代谢物、前体药物或立体异构体中的一者或多者。4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述化合物选自蛋白激酶抑制剂和受体激酶抑制剂。5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述化合物选自来他替尼(CEP701，)SU11652舒尼替尼(SU11248，)、博舒替尼(SKI606，)、Jak3抑制剂VI纳曲吲哚美索曲明四盐酸盐R(-)-α-甲基-组胺二盐酸盐PD160170N6-环戊基腺苷布地奈德BAY-439006(即索拉非尼；HMSL10008-101-1)、HG-6-64-01(即HMSL10017-101-1)、HKI-272(即来那替尼；HMSL10018-101-1)、KIN001-055(即HY-11067；HMSL10033-101-1)、SB239063(即HMSL10036-101-1)、KIN001-242(即HMSL10044-104-1)、SB590885(即GSK2118436；HMSL10046-101-1)、AZ-628(即HMSL10050-101-1)、MK2206(即HMSL10057-102-1)、XMD11-50(即LRRK2-in-1；HMSL10086-101-1)、XMD8-92(即HMSL10094-101-1)、BIRB796；达马莫德(即HMSL10169-101-1)、苹果酸舒尼替尼(即SU11248；索坦；HMSL10175-106-1)、GDC-0879(即HMSL10181-101-1)、XMD8-85(即HMSL10093-101-1)、AMN-107(即尼罗替尼；HMSL10099-101-1)、Y39983(即HMSL10149-102-1)、SB203580(即RWJ64809；PB203580；HMSL10167-101-1)、VX-745(即HMSL10168-101-1)、假XL765(即HMSL10173-101-1)、Y-27632(即HMSL10176-101-1)、PH-797804(即HMSL10439-101)、VX-702(即HMSL10440-101)、NG25(即HMSL10419-101)、SB202190(即HMSL10441-101)、BI-D1870(即HMSL10423-101)、BIX02565(即HMSL10434-101)、URMC-099(即HMSL10453-101)、星形孢菌素糖苷配基(即K252C；HMSL10454-101)、瑞利替尼(即LY2228820；HMSL10438-103)、BMX-IN-1(即HMSL10427-101)、PF3644022(即HMSL10476-101)、NVP-BHG712(即KIN001-265；HMSL10200-101)、博舒替尼(即SKI-606；HMSL10189-101)、NVP-TAE226(即CHIR-265；HMSL10207-101)、RAD001(即依维莫司；HMSL10235-101)、CC-401(即HMSL10185-101)、CGP74514A(即HMSL10355-101)、KIN001-269(即HMSL10195-101)、RAF265(即HMSL10206-101)、OTSSP167(即HMSL10337-102)、多索吗啡(即化合物C；BML275；HMSL10399-102)、劳施迈匹莫(即GSK-AHAB；SB856553；GW856553X；HMSL10402-101)、AZD5363(即HMSL10370-101)、RO31-8220(即双吲哚基马来酰亚胺IX；HMSL10407-103)、索彻斯托(即AEB071；HMSL10408-101)、TAK-632(即HMSL10409-101)、FRAX597(即HMSL10400-101)、GW2580(即HMSL10401-101)、阿利斯提(即MLN8237；HMSL10391-101)、(+)-JQ1、S)-JQ1、贝利司他(即PXD101)、MS-275(即恩替诺特；MS-27-275)、伏立诺他(即辛二酰苯胺氧肟酸(SAHA)、Zolinza)、塞提诺他(即MGCD0103)、I-BET(即GSK525762A)、SB939(即帕西诺他)、PFI-1)、若西诺他(即ACY-1215)、I-BET151(即GSK1210151A)、IOX2及其任何组合。6.权利要求1-5任一项的方法，其中将所述化合物以约0.01nM至约100μΜ的浓度与所述卫星细胞相接触。7.权利要求1-6任一项的方法，其中所述接触进行至少1小时。8.权利要求1-7任一项的方法，其中所述接触进行1至7天。9.权利要求1-8任一项的方法，其中所述接触在体外进行。10.权利要求1-9任一项的方法，其中所述接触离体进行。11.权利要求1-10任一项的方法，其中所述接触在体内进行。12.权利要求11的方法，其中体内接触是在哺乳动物中。13.权利要求11或12的方法，其中体内接触是在人类中。14.权利要求11-13任一项的方法，其中体内接触是在对象中，其中所述对象需要进行受损肌肉组织的治疗。15.权利要求14的方法，其中所述受损肌肉组织是物理伤害或事故、疾病、感染、过度使用、血液循环丧失或肌肉萎缩或消耗的结果。16.权利要求14或15的方法，其中所述受损肌肉组织是营养不良的肌肉或衰老的肌肉。17.权利要求14-16任一项的方法，其中所述受损肌肉组织是肌肉萎缩/消耗的结果。18.一种用于对象中的肌肉修复或再生的方法，所述方法包括向所述对象给药治疗有效量的化合物，所述对象具有受损肌肉组织，并且其中所述化合物选自激酶抑制剂、G蛋白偶联受体(GPCR)调节剂、组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)调节剂、表观遗传修饰剂、hedge...

【专利技术属性】
技术研发人员：李·L·鲁宾，埃米·J·瓦格尔斯，阿曼达·K·W·吉，菲奥多尔·D·普赖斯，
申请(专利权)人：哈佛学院校长同事会，
类型：发明
国别省市：美国,US