十字孢碱在抗鸡球虫病中的应用制造技术

本发明专利技术公开了十字孢碱在抗鸡球虫病中的应用。十字孢碱与可接受的辅料混合均匀，添加在饲料中，可有效抵抗鸡球虫在鸡体内的繁殖。与常规抗球虫药物磺胺氯吡嗪钠可溶性粉相比，抗球虫效果明显。本发明专利技术可有效缓解当前养殖业使用抗球虫药物产生的严重耐药性问题，可以在此基础上加快新药的研发速度，对养殖业的绿色、健康发展具有重要益处。

The application of cruciate in anti coccidiosis

The invention discloses the application of cross spore alkali in resisting coccidiosis. The mixture of cruciosine and excipient is homogeneous, and it can effectively resist coccidian reproduction in chickens. Compared with the conventional anti coccidiosis drug sulfadiazine sodium soluble powder, the anti coccidiosis effect is obvious. The invention can effectively alleviate the serious drug resistance caused by the use of anti coccidiosis drugs in the current breeding industry, and can speed up the research and development of new drugs on this basis, and have important benefits for the green and healthy development of the breeding industry.

【技术实现步骤摘要】
十字孢碱在抗鸡球虫病中的应用
本专利技术涉及生物医药领域，特别涉及十字孢碱在抗鸡球虫病中的应用。
技术介绍
十字孢碱(stsurosporine)，别名：星孢菌素、链霉菌属十字孢碱、十字孢碱、星形孢菌素，是一种从Staurosptomycesstaurosporeus培养液中分离出来的吲哚咔唑生物碱。该化合物为淡黄色粉末状物质，易溶于DMSO、甲醇、乙醇、不溶于水。该化合物的分子式为：C28H26N4O3，分子量为：466.53，CAS登录号：62996-74-1。十字孢碱具有多种药理活性，如抗肿瘤、抗真菌、抗细菌、抑制血小板凝集、抑制平滑肌收缩活性、抑制蛋白激酶及促进细胞变异等活性。鸡球虫病(Coccidiosis)是由艾美耳属(Eimeria)的球虫寄生于鸡肠道黏膜细胞所引起的一种传染性疾病。据统计，全世界已报道的7种鸡球虫中，有5种具有明显的致病性，分别是为柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)、毒害艾美耳球虫(E.necatrix)、巨型艾美耳球虫(E.maxima)、堆形艾美耳球虫(E.acervulina)及和缓艾美耳球虫(E.mitis)。鸡球虫病发生广泛，几乎有养鸡的地方就会有球虫病的发生，而规模化鸡场是球虫病发生的最适宜场所，常常出现爆发。雏鸡和青年鸡易感染球虫，发病率和致死率高达80％以上，病愈的雏鸡生长受阻，增重缓慢；成年鸡一般不发病，多为带虫者，增重和产蛋能力下降，是传播球虫病的重要病源。因此，鸡球虫病每年给养禽业造成巨大的经济损失。在养鸡业集约化程度日益提高的今天，鸡球虫病的防控主要采用活卵囊疫苗免疫和药物相结合的方式。但是由于疫苗免疫存在散毒的风险，因此化学药物仍是防控该病的主要措施。在上世纪80年代，由于大量抗球虫药物的出现，鸡球虫病的防控取得令人满意的成效。但是大多数抗球虫药物多为化学类产品和抗生素类产品，随着这些药物的长期使用，导致鸡球虫产生非常严重的抗药性，而新药研发速度又十分缓慢，致使当前养鸡业面临无新药可用的局面，因此迫切需要新的抗球虫药物面市。因此，是否可以将诸如十字孢碱等人用药物，运用于养殖中，就显得十分重要了。
技术实现思路
本专利技术的目的在于公开十字孢碱在抗鸡球虫病中的应用。本专利技术所采取的技术方案是：十字孢碱在制备治疗鸡球虫病药物中的应用。十字孢碱在制备抗鸡球虫子孢子入侵药物中的应用。十字孢碱在制备预防鸡球虫病药物中的应用。一种治疗鸡球虫病的组合物，组合物中含有十字孢碱。本专利技术的有益效果是：十字孢碱抗球虫效果明显，可有效缓解当前养殖业使用抗球虫药物产生的严重耐药性问题，可以在此基础上加快新药的研发速度，对养殖业的绿色、健康发展具有重要益处。附图说明图1十字孢碱不同浓度对子孢子入侵的影响。具体实施方式实施例11.鸡球虫卵囊的繁殖取14日龄20只岭南黄肉鸡经口接种E.tenellaGD株新鲜孢子化卵囊，每只鸡接种5×104个，7.5天后，处死试验鸡，收集粪便，采用饱和盐水漂浮法纯化并收集鸡球虫卵囊，以2.5％(w/v)重铬酸钾溶液重悬卵囊沉淀，置于28～30℃水浴中震荡培养24～48h，待孢子化率达80％以上时，计数卵囊，置于2～8℃条件下备用。2.鸡球虫孢子化卵囊的纯化将孢子化卵囊以4000rpm/min离心10min，弃去重铬酸钾溶液，以双蒸水重悬卵囊，直至重铬酸钾溶液清洗完全；卵囊沉淀以30％(v/v)次氯酸钠溶液重悬并室温静置10min，吸取上层卵囊溶液按1：5(v/v)加入灭菌双蒸水，10000rpm/min离心1min，弃去上清，用灭菌双蒸水同上洗涤3次，最后将沉淀重悬于PBS溶液中(以下PBS均同)。3.鸡球虫子孢子的提取及纯化将纯化的孢子化卵囊用灭菌玻璃珠破碎，待80％以上的卵囊破碎完全，离心收集孢子囊，置于消化液(含1％(W/V)胰蛋白酶和5％(V/V)鸡胆汁)中，在41℃恒温摇床中消化约1h，镜检至80％以上的孢子囊释出子孢子，用灭菌G3漏斗过滤纯化；将子孢子溶液以10000rpm/min离心1min，弃去上清，用PBS溶液洗涤3次，除去胰蛋白酶和鸡胆汁，最后将子孢子重悬于PBS溶液中并计数，置于2～8℃条件下备用。以上过程均需无菌操作。4.细胞培养MDBK细胞生长至融合状态达80％以上时，弃去培养基，以PBS洗涤3次，用0.25％(W/V)的胰蛋白酶消化液进行消化，以含10％胎牛血清的RPMI1640培养基调整细胞浓度为2×105个/mL，将细胞液接入24孔细胞培养板，1mL/孔，置于37℃含5％CO2的生化培养箱中过夜培养。5.子孢子感染细胞待24孔细胞培养板的细胞生长至融合状态达80％及以上时，弃去培养基，以PBS洗涤3次，用含1％胎牛血清的RPMI1640培养基调整子孢子的浓度分别为3×105个/mL，每孔加入含子孢子的培养基1mL，同时加入十字孢碱，终浓度为1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL，以DMSO做对照。置于37℃含5％CO2的生化培养箱中继续培养，6h后弃去培养基，PBS洗涤3次。按照下述方法检测入侵率对于每个对应组来说，以CT[EtActin]来表示寄生虫内参基因的CT值，以CT[BActin]来表示模型细胞内参基因的CT值则△CT＝CT[EtActin]-CT[BActin]，△CT表示该组寄生虫内参基因相对于人内参基因的表达量。那么△△CTn＝△CTn-△CT1，N表示第n个样品，1表示对照组。△△CTn则表示第n组与对照组的寄生虫内参基因相对表达量。同时知道△△CT与与基因量P存在Log[p]＝A·△△CT+B的关系那么可以知道：Log(Pexp/Pctl)＝Log[Pexp]-log[Pctl]＝A·(△△CT-△△CT[ctl])。因为对照组△△CT[ctl]为△CT1-△CT1＝0则有Log(Pexp/Pctl)＝A·△△CTε为翻译效率，大于1小于2的常数，当PCR片段小于150，反应条件优化良好情况接近2，故本试验以2代替。有本公式可知对照组△△CT0＝0，故入侵率为100％，而对照组取样方法为所有细胞和3×105个子孢子。根据以上推导过程可知试验结果数据处理为方法为：①求各组CT值均值。②所有试验组和对照组的△CT值：△CT0、△CT2、△CT4、△CT6……△CTn及标准差。③求各组△△CTn.＝△CTn-△CT0及标准差。④求各组相对于对照组的及标准差。当24孔板细胞铺板剂量为2×105个/孔，子孢子接种剂量为3×105个/孔，利用Real-timePCR方法检测不同浓度十字孢碱对子孢子入侵率的影响，结果当加入十字孢碱后，子孢子的入侵率降低，并且随着十字孢碱浓度的增加，入侵率不断降低，说明十字孢碱对子孢子入侵宿主细胞具有抑制作用(见图1)。实施例21.鸡球虫卵囊的繁殖取14日龄20只岭南黄肉鸡经口接种E.tenellaGD株新鲜孢子化卵囊，每只鸡接种5×104个，7.5天后，处死试验鸡，收集粪便，采用饱和盐水漂浮法纯化并收集鸡球虫卵囊，以2.5％(w/v)重铬酸钾溶液重悬卵囊沉淀，置于28～30℃水浴中震荡培养24～48h，待孢子化率达80％以上时，计数卵囊，置于2～8℃条件下备用。2.分组将14日龄岭南黄肉鸡逐只称重，淘汰弱雏和体重过大者，将体重均匀的1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.十字孢碱在制备治疗鸡球虫病药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.十字孢碱在制备治疗鸡球虫病药物中的应用。2.十字孢碱在制备抗鸡球虫子孢子入侵药物中的应用。3.十字...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴彩艳，廖申权，孙铭飞，李娟，戚南山，吕敏娜，林栩慧，胡俊菁，
申请(专利权)人：广东省农业科学院动物卫生研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44