一种比率型荧光检测方法及应用技术

本发明专利技术属于纳米成像探针应用技术领域，公开了一种比率型荧光检测方法及应用。本发明专利技术所提供的比率型荧光检测方法包括：将纳米探针加入到待测样本中，在同一束激发光的激发下，纳米探针中的两种荧光团分别发射波长相同的长寿命荧光信号和短寿命荧光信号；使用时间门荧光探测装置，关闭时间门功能，收集所述长寿命荧光信号和短寿命荧光信号的总强度；开启时间门功能，收集所述长寿命荧光信号的强度；以所述长寿命荧光信号强度与所述长寿命荧光信号、短寿命荧光信号总强度的比率值表征待测样本中待测物的浓度。利用本发明专利技术的方法检测可获得高准确度的原位比度信号，显著提高荧光检测的准确性，特别适用于活体检测中。

【技术实现步骤摘要】
一种比率型荧光检测方法及应用
本专利技术属于纳米成像探针应用
，特别涉及一种比率型荧光检测方法及应用。
技术介绍
光学成像在科学探究生物体内部结构及生命活动过程中一直扮演着非常重要的角色。经过了几十年的发展，人们已经实现了从细胞到组织到活体的多尺度高灵敏成像。而光学检测由于无损非侵入式，灵敏，耗时短，功能强大等原因在临床检测中一直有着广泛的应用。现有的比率成像模式通常是用一束激发光激发起来自两种不同荧光材料的、波长不同的两束荧光，然后利用这两束荧光强度的比值来判断样本中待测物量的多少。这种比率模式相对于利用单一荧光强度信号的检测模式排除了探针浓度本身对于定量检测的干扰。然而，已有研究表明，不同波长的光在样本内部传播能力或者穿透能力是由光的波长和样本的种类决定的，所以两束光穿透同一样本后的衰减程度是不一样的，因此，在样本外部检测到的两束光的比率值和在样本内部原位处的比率值是不相等的，也就是说这一检测到的比率值是与探针在样本内所处深度相关的。现有的另一种比率成像的技术原理也类似，采用两束不同的激发光去激发荧光探针收得两束不同的荧光信号，待测物的引入会改变某一激发条件下的能量传递过程进而引起荧光强度的变化；而另一激发条件下的传能过程通常不受待测物加入的影响，荧光强度也不发生改变，最终用这两束荧光的强度比率值来判断待测物的多少。然而，这种比率成像技术也存在相同的缺点，两束激发光的波长不一样，穿透样本后的衰减程度也不一样，所以相同待测物浓度情况下，光强的比率值还跟阻挡的样本组织的厚度和种类有关，无法实现样本内部复杂情况下对待测物量的准确测定。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可获得高准确度原位比度信号的比率型荧光检测方法及应用。为解决上述技术问题，本专利技术的实施方式所提供的比率型荧光检测方法，包括如下步骤：(1)将纳米探针加入到待测样本中，所述纳米探针包含两种荧光团；(2)在同一激发光的激发下，所述两种荧光团分别发射波长相同的长寿命荧光信号和短寿命荧光信号；(3)使用时间门荧光探测装置，关闭时间门功能，收集所述长寿命荧光信号和短寿命荧光信号的总强度；开启时间门功能，收集所述长寿命荧光信号的强度；(4)以所述长寿命荧光信号强度与所述长寿命荧光信号、短寿命荧光信号总强度的比率值表征待测样本中待测物的浓度。所述待测样本包括人体、动物体、模式动物或复杂样本。相对于现有技术而言，本专利技术的实施方式所提供得的高准确度原位比度信号的方法的核心有以下两个。第一，是单激发同波长双发射的比率成像模式，这种成像模式输出的比度信号(即样本外探测到的比度信号)与原位比度信号值非常接近。申请人认为，首先，荧光的强度与荧光团的浓度相关，所以无法使用单一的荧光信号强度去定量的标定待测物的多少；其次，样本深处的光在进入和穿透样本内部的过程中会有吸收和散射过程发生，导致检测到的光强并不等于原位的信号强度。现有的比度检测成像模式，即用两束荧光强度的比率值Iλ1/Iλ2(λ1≠λ2)来标定待测物的多少，虽可以提供相对准确的定量信息；然而，根据生物光子学，不同波长的光在样本内部的传播能力并不相同。在传输理论中，使用吸收系数μa和散射系数μs来表征光子在单位长度上发生吸收和散射的概率。吸收和散射系数都是光的波长和生物组织类型的函数，总的来说样本内部组织对光的吸收系数随光的波长增加而忽大忽小，而生物组织对光的散射系数随光的波长增加而单调下降，且不同组织对相同波长的光的系数和散射系数不同。所以上述传统的比率模式所检测到的体外比度信号与原位处的比度信号是不相等的，是存在显著偏差的。而本专利技术创新性地利用两束波长相同的荧光的强度比率值来表征待测物浓度，而且这两束荧光是用一束激发光激发出来的，即单激发同波长双发射的比率成像/检测模式，这样可以最大程度的消除样本内部组成对荧光的吸收和散射过程对输出比度信号值的干扰，最大程度地实现对原位比度信号的保真。第二，是适用这一成像模式的探针及时间门荧光探测装置。传统的光谱测量技术或者宽场成像技术是无法实现对同波段荧光信号的区分或者分别收集的。要实现本专利技术的比率型荧光检测方法，还需要配合特定的双通道解码同波段荧光技术，包括探针和时间门荧光探测装置。该种探针中所包含的两种荧光团能分别发射同波长的长寿命荧光信号和短寿命荧光信号；通过时间门荧光探测装置中的时间门功能的开启和关闭，可收集到长寿命荧光信号和短寿命荧光信号，从而完成了双通道解码同波段荧光。在本专利技术的实施方式所提供的比率型荧光检测方法中，所述时间门荧光探测装置包括时间门单元和成像单元，所述时间门单元包括波形发生器和斩波器；所述成像单元包括环形激光、镜头和相机。斩波器向波形发生器输出信号，波形发生器控制环形激光发射激发光。上述时间门荧光探测装置以激发光关闭与斩波器开启之间的时间差作为延迟的时间门控，区分长寿命、短寿命的荧光信号。该种时间门荧光探测装置的工作过程中，在当时间门功能关闭时，两束荧光全部可以穿过斩波器中间的空档进入相机中，检测器收集到的是粒子和染料总的发光；当时间门功能开启时，通过设置适当的斩波器旋转频率及激光开启闭合的时间即可使得只有长寿命的粒子发光能够透过斩波器叶片中间的空档进入相机而短寿命的荧光被斩波器的叶片挡住。通过控制时间门功能的开闭，就能获得两束波长相同的荧光。优选地，在本专利技术的实施方式所提供的比率型荧光检测方法中，纳米探针中的两种荧光团各自独立地选自：纳米粒子、有机染料、配合物和量子点，只要这两种荧光团可分别发射同波长、且可区分的长寿命荧光信号和短寿命荧光信号即可。优选地，本专利技术实施方式中的纳米探针可为NaYF4:5％Nd@Cy860@PC、NaYF4:20％Yb@Cy965@PC、NaYF4:5％Nd@Rh780@PC或NaYF4:1％Tm@Rh760@PC。以NaYF4:5％Nd@Cy860@PC为例，在该种纳米探针中，纳米粒子NaYF4:5％Nd的寿命为53微秒，有机染料Cy860的寿命为纳秒级别。纳米粒子和有机染料的发光寿命的区别，决定了可通过时间门的筛选有效消除有机染料的短寿命荧光、只保留长寿命纳米粒子的发光。另外，通过卵磷脂(PC)的包裹使得复合材料在水中具有良好的水溶性、分散性及生物相容性。此外，由于有机染料Cy860对次氯酸有特异性响应，整个复合探针对于次氯酸同样具有特异性响应，随着次氯酸的加入染料的发光逐渐减弱，粒子的发射逐渐恢复。本专利技术的实施方式还提供上述比率型荧光检测方法在活体内光学定量检测中的应用。附图说明图1是本专利技术具体实施方式中的比率型荧光检测方法的原理示意图；图2是实施例1中制备的NaYF4:5％Nd@Cy860@PC纳米探针的电镜图；图3是实施例1中随着次氯酸的加入，使用时间门荧光探测装置，分别在时间门功能开启(3-A)和关闭(3-B)状态下检测到的纳米探针的荧光发射强度变化；图4是实施例1中根据附图3中的荧光发射强度变化得出的0mm组、2mm组和3mm组的长寿命荧光信号、短寿命荧光信号总强度的比率值；图5是实施例1中随着次氯酸的加入，以常规光谱仪检测得到的纳米探针的发光强度变化；图6是实施例2中随着PH值变化，使用时间门荧光探测装置，分别在时间门功能开启(6-A)和关闭(6-B)状态下检测到的纳米探针的荧光发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种比率型荧光检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将纳米探针加入到待测样本中，所述纳米探针包含两种荧光团；(2)在同一束激发光的激发下，所述两种荧光团分别发射波长相同的长寿命荧光信号和短寿命荧光信号；(3)使用时间门荧光探测装置，关闭时间门功能，收集所述长寿命荧光信号和短寿命荧光信号的总强度；开启时间门功能，收集所述长寿命荧光信号的强度；(4)以所述长寿命荧光信号强度与所述长寿命荧光信号、短寿命荧光信号总强度的比率值表征待测样本中待测物的浓度。

【技术特征摘要】
1.一种比率型荧光检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将纳米探针加入到待测样本中，所述纳米探针包含两种荧光团；(2)在同一束激发光的激发下，所述两种荧光团分别发射波长相同的长寿命荧光信号和短寿命荧光信号；(3)使用时间门荧光探测装置，关闭时间门功能，收集所述长寿命荧光信号和短寿命荧光信号的总强度；开启时间门功能，收集所述长寿命荧光信号的强度；(4)以所述长寿命荧光信号强度与所述长寿命荧光信号、短寿命荧光信号总强度的比率值表征待测样本中待测物的浓度。2.根据权利要求1所述的比率型荧光检测方法，其特征在于，所述待测样本包括人体、动物体、模式动物或复杂样本。3.根据权利要求1所述的比率型荧光检测方法，其特征在于，所述时间门荧光探测装置包括时间门单元和成像单元，所述时间门单元包括波形发生器和斩波器；所述成像单元包括环形激光、镜头和相机。且所述时间门荧光探测装置以激发光关闭与斩波器开启之间的时间差作为延迟的时间门控，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李富友，程胜名，冯玮，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海,31