促进纤维丙酮丁醇乙醇发酵生产的酶解缓冲液及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种促进纤维丙酮丁醇乙醇发酵生产的酶解缓冲液及其应用。该酶解缓冲液是利用可以被产丁醇梭菌代谢的丁酸等有机弱酸与微生物代谢所必须的金属的氢氧化物或氨水所提供的阳离子配制而成，其pH为4‑7，适用于纤维素酶酶解木质纤维素，且在酶解完成后，通过加入碱性物质调节pH，即可实现纤维的丙酮丁醇乙醇的发酵生产，而无需提供其他外源营养物质。本发明专利技术提供了一种简化的酶解缓冲液配制方案，有效解决了传统的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液对丙酮丁醇乙醇发酵的抑制问题，通过酶解过程中加入乙酸、丁酸等中间产物，影响丙酮丁醇乙醇代谢流，促进溶剂的高效生产。

【技术实现步骤摘要】
促进纤维丙酮丁醇乙醇发酵生产的酶解缓冲液及其应用
本专利技术属于木质纤维素资源化利用
，具体涉及一种促进纤维丙酮丁醇乙醇发酵生产的酶解缓冲液及其应用。
技术介绍
正丁醇是一种重要的大宗化学品和潜在的替代燃料，广泛应用于工、食品、医药等领域。利用木质纤维素原料，通过丙酮-丁醇-乙醇(ABE)发酵制备生物基正丁醇具有可再生、环境友好等优势，是近年来研究的热点。然而，除ABE发酵存在较高的产物抑制外，产丁醇微生物多对外界环境和刺激较为敏感。在木质纤维素转化为生物基正丁醇的工艺路线中，木质纤维素通过预处理手段实现解聚，在解聚之后，通过酶解糖化获得纤维糖水解液，在通过产丁醇微生物将纤维糖酶解液中的糖分转化为丙酮、丁醇等物质。在此过程中，为实现纤维素酶解最适pH，提高纤维素酶解效率，通常利用强碱弱酸型盐溶液作为缓冲剂，稳定纤维素酶解过程中水相的pH。目前常用于木质纤维素酶解的缓冲剂多为一定浓度的，由柠檬酸/柠檬酸钠配制而成的pH在4.5-5.5的盐溶液。该类盐溶液具备较强的稳定性，在酶解后，含有柠檬酸/柠檬酸钠盐的酶解液适用于多种生物化学品的发酵。然而遗憾的是，添加柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液形成的酶解液对ABE发酵产生明显的抑制。有报道显示(ChuangXue等,“Thevitalroleofcitratebufferinacetone–butanol–ethanol(ABE)fermentationusingcornstoverandhigh-efficientproductrecoverybyvaporstripping–vaporpermeation(VSVP)process”[J],BiotechnologyforBiofuels,2016,9,146)，对于丁醇发酵，当酶解过程的柠檬酸/柠檬酸钠盐浓度从30mM提升至100mM时，发酵结束后，丁醇和ABE总溶剂的浓度分别由11.2g/L和19.8g/L降低至6.4g/L和11.1g/L。其原因是该类缓冲盐降低细胞内的pH值和质子的动力，抑制产丁醇菌株的生长，影响细胞膜的通透性(LiuK.等,“Pardo-PlanasO,etal.ProcessdevelopmentforbiologicalproductionofbutanolfromEasternredcedar”[J],BioresourceTechnology,2015,176,88-97)。此外，在酶解结束后，未解离的柠檬酸具有较高渗透压，直接影响细胞的代谢生长(AroraA,等,“Understandingthepinediluteacidpretreatmentsystemforenhancedenzymatichydrolysis”[J],ACSSustainableChemicalEngineering,2015,3,2423-2428)。而柠檬酸/柠檬酸钠也会螯合培养基内部分发酵必须的微量元素，进而影响细胞的代谢(ElizabethCasey等,“EffectofsaltsontheCo-fermentationofglucoseandxylosebyageneticallyengineeredstrainofSaccharomycescerevisiae”,BiotechnologyandBiofuels,2013,6,83)。为解决传统的柠檬酸/柠檬酸钠酶解缓冲液对丙酮丁醇发酵的抑制，一些研究采用乙酸/乙酸钠缓冲盐溶液代替柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液或将其作为发酵培养基的一部分，在酶解结束后添加，在随后的发酵过程中，均获得了较小的抑制和较好的丙酮丁醇发酵效果(IbrahimMF等,“Oilpalmemptyfruitbunchasalternativesubstrateforacetone–butanol–ethanolproductionbyClostridiumbutyricumEB6”[J],AppliedBiochemistryandBiotechnology,2012,166,1615-1625；QureshiN等,“SoymolassesasfermentationsubstrateforproductionofbutanolusingClostridiumbeijerinckiiBA101”[J],JournalofIndustrialMicrobiologyandBiotechnology,2001,26,290-295)。这类方法的原理是乙酸作为共同碳源，将细胞内部乙酸浓度维持在较高水平，提高产丁醇微生物代谢途径中，催化丙酮合成的CoA转移酶的活性，进而强化ABE代谢过程中丙酮的合成(ChenCK等,“EffectofacetateonmolecularandphysiologicalaspectsofClostridiumbeijerinckiiNCIMB8052solventproductionandstraindegeneration”[J],AppliedEnvironmentalMicrobilogy,1999,65,499-505)。为此，专利CN105483164A以此原理为基础，在发酵产溶剂期加入一定浓度的乙酸，胁迫丙酮丁醇梭菌代谢生产较高浓度丙酮。然而，在酶解过程中添加乙酸/乙酸钠缓冲盐溶液尽管能一定程度上促进丙酮的代谢，但无法实现对丁醇代谢的促进和提升。此外，在传统的缓冲盐系统的酶解过程后，由于酶解液中营养物质的匮乏，丙酮丁醇梭菌代谢生产能力较差，多需要外源加入外源营养物质，如氨基酸、无机盐等，以满足高效的丙酮丁醇代谢生产。外源营养物质的添加无疑增加了纤维丙酮丁醇发酵的复杂程度，提升了发酵过程的染菌概率。因此，目前存在的问题是需要研究开发一种既能够促进丙酮和丁醇代谢，又不需添加外源营养物质的多功能酶解缓冲液。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种促进纤维丙酮丁醇乙醇发酵生产的酶解缓冲液。该酶解缓冲液能够提供使木质纤维素高效降解的水环境，且能够刺激和促进酶解后的丙酮、丁醇和乙醇的生成，其中缓冲剂中的阴离子源可以进一步作为碳源底物被产丁醇菌利用，同时，该缓冲液还能够提供ABE发酵所需的多数微量营养物质。为此，本专利技术第一方面提供了一种酶解缓冲液，其包括的阴离子源，所述阴离子源为丁酸根或含有丁酸根的混合物。在本专利技术的一些实施例中，所述含有丁酸根的混合物包括含有丁酸根和其他阴离子的混合物。在本专利技术的一些具体优选的实施例中，所述其他阴离子为乙酸根。在本专利技术的一些优选的实施例中，所述含有丁酸根和其他阴离子的混合物为乙酸根和丁酸根的混合物。在本专利技术的另一些优选的实施例中，所述含有丁酸根和其他阴离子的混合物为去除乙醇、丁醇、丙酮的含有乙酸、丁酸的丙酮-丁醇-乙醇(ABE)发酵液。根据本专利技术，所述酶解缓冲液还包括阳离子源，所述阳离子源包括金属阳离子和/或由氨气或氨水经过与阴离子源混合后形成的NH4+。在本专利技术的一些实施例中，所述金属阳离子包括K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Co2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+和Mn2+中的一种或多种。在本专利技术的一些实施例中，在所述酶解缓冲液中阴离子源与阳离子源的总摩尔比为(1-5):1，优选为(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酶解缓冲液，其包含阴离子源，所述阴离子源为丁酸根或含有丁酸根的混合物；优选含有丁酸根的混合物包括含有丁酸根和其他阴离子的混合物；优选其他阴离子为乙酸根。

【技术特征摘要】
1.一种酶解缓冲液，其包含阴离子源，所述阴离子源为丁酸根或含有丁酸根的混合物；优选含有丁酸根的混合物包括含有丁酸根和其他阴离子的混合物；优选其他阴离子为乙酸根。2.根据权利要求1所述的酶解缓冲液，其特征在于，所述含有丁酸根和其他阴离子的混合物为乙酸根和丁酸根的混合物；或者，所述含有丁酸根和其他阴离子的混合物为去除乙醇、丁醇、丙酮的含有乙酸、丁酸的丙酮-丁醇-乙醇发酵液。3.根据权利要求2所述的酶解缓冲液，其特征在于，在所述丁酸根和乙酸根的混合物中，基于丁酸和乙酸的质量计的丁酸根与乙酸根的质量比为(1-10):1优选为(1-3):1，进一步优选为(1-2):1。4.根据权利要求1-3中任意一项所述的酶解缓冲液，其特征在于，所述酶解缓冲液还包括阳离子源，所述阳离子源包括金属阳离子和/或由氨气或氨水经过与阴离子源混合后形成的NH4+；优选所述金属阳离子包括K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Co2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+和Mn2+中的一种或多种。5.根据权利要求4所述的酶解缓冲液，其特征在于，在所述酶解缓冲液中阴离子源与阳离子源的总摩尔比为(1-5):1，优选为(1-3):1。6.根据权利要求1-5中任意一项所述的酶解缓冲液，其特征在于，所述酶解缓冲液的pH为4-7，优选pH为4-6，进一步优选为4.5-5.5；和/或，所述酶解缓冲液中，阴离子源的的总浓度为5-100...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭天伟，蔡的，张长伟，秦培勇，陈长京，曾海旺，周明园，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：北京,11