本发明专利技术涉及水产品质量安全检测技术领域，尤其涉及一种水产品中内外源性雌性激素的液相色谱串联质谱检测方法，包括以下步骤(1)沉淀蛋白；(2)涡旋振摇萃取；(3)凝胶渗透色谱净化；(4)液相色谱‑串联质谱检测。本发明专利技术取乙腈与乙酸乙酯沉淀蛋白，以乙酸乙酯为萃取剂进行涡旋振摇提取水产品中的雌性激素，将提取上清液氮吹浓缩后用环己烷‑乙酸乙酯复溶解，再经凝胶色谱净化去除提取物中的干扰物，净化液经旋转蒸发吹至近干，利用液相色谱串联质谱进行多反应监测检测，内标法定量。该方法操作方便，重现性较好，定性准确且回收率较高，能够快速分析水产品中8种内外源性雌性激素。
【技术实现步骤摘要】
一种水产品中内外源性雌性激素的液相色谱串联质谱检测方法
本专利技术涉及水产品质量安全检测
，尤其涉及一种水产品中内外源性雌性激素的液相色谱串联质谱检测方法。
技术介绍
雌激素是卵巢分泌的一类类固醇激素，其中雌二醇、雌酮等属于天然雌激素，己烯雌酚、已二烯雌酚等属于合成雌激素。雌性激素药物具有促进动物体内营养物质沉积和改善生产性能的作用，能显著提高动物养殖的经济效应，广泛应用于动物养殖中。也有不法分子可能会在养殖过程中使用含有雌激素饲料，会导致其在动物源性产品中残留。测定水产品中的雌性激素含量，有利于科研人员掌握和分析水产品中的雌性激素含量，有利于国家水产品质量安全的监管，对水产品质量安全有保障作用。水产品中雌激素水平不仅受养殖环境的影响，而且与其生活习性、生物特性等因素紧密相关。因此不同水产品雌水平相差也很大，且水产品基质较复杂。如何通过有效地样品前处理技术和仪器分析技术，建立一种回收率高、重现性好、精确度高的水产品中雌性激素的检测方法，成为研究的关键。目前有关国内外雌激素类检测方法主要集中在环境水样、化妆品、乳制品中，主要的检测技术有免疫法、液相色谱法、气相色谱质谱法、液相色谱质谱法等，前处理技术一般按固相萃取净化、分散固相萃取净化、分子印迹技术等。凝胶渗透色谱又称分子筛凝胶色谱，是20世纪60年代开发的一种净化分离技术。由于凝胶渗透色谱具有按溶质分子体积大小分离的独特长处，而且对流动相的要求较低，实验条件相对温和，重复性好，溶质回收率高等特点，因此GPC在色素、富含脂肪等大分子的样品净化方面，拥有自己显著的优势，在食品安全方面等应用广泛，但应用于水产中雌激素残留分析较少。水产品样品基质复杂，若样品前处理过程中杂质去除不好，可直接干扰仪器的测定结果，甚至损坏仪器。因此如何高效地从水产品中提取雌性激素并进行净化，成了水产品中雌性激素分析的一个瓶颈。
技术实现思路
本专利技术为了克服现有水产品中雌性激素分析方法具有局限性、前处理要求高、干扰因素多的问题，提供了一种快速、准确的对水产品中内外源性雌性激素的测定方法，以实现水产品中内外源性雌性激素的定量及定性测定。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种水产品中内外源性雌性激素的液相色谱串联质谱检测方法，包括以下步骤：(1)沉淀蛋白：称量约2.0g匀浆后的水产品于50mL离心管中，准确加入10μL内标混合溶液，避光放置2min，加入6mL的乙腈-乙酸乙酯混合液；加盖振荡混匀3min，沉淀蛋白；(2)涡旋振摇萃取：加入10mL的乙酸乙酯，涡旋振摇10min后，在4℃下10000r/min离心10min，取上清液转移至玻璃管中，再用5mL的乙酸乙酯重复提取一次，合并上层有机液；在45℃下，氮气吹干，残渣用10.0mL环己烷-乙酸乙酯混合液溶解，过0.45μm的有机微孔膜，供凝胶色谱净化用；(3)凝胶渗透色谱净化：层析柱：30mm×210mm，填料Bio-BeadsSX3，中性、多孔的聚苯乙烯-二乙烯基苯微球体，流动相：环己烷-乙酸乙酯混合液，流速：5mL/min，进样量：5mL；收集15～26.7min的洗脱液，于45℃下旋至近干后45℃条件下氮气吹干，加入1mL的甲醇/水混合液复溶解，得复溶液；(4)液相色谱-串联质谱检测：取定容后的复溶液，经0.22μm的有机滤膜过滤到样品小瓶中，进行液相色谱-串联质谱检测，绘制标准工作曲线，以内标法定量，根据峰面积计算雌性激素的浓度。本专利技术的液相色谱串联质谱检测方法可以用于检测雌三醇、17α-雌二醇、17β-雌二醇、炔雌醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、己二烯雌酚。作为优选，步骤(4)中，色谱条件为：采用ACQUITYUPLCBEHC18柱(2.1mm×100mm,1.7μm)分离；流动相：A相：0.1％氨水；B相：乙腈；样品温度为25℃，柱温为30℃，进样体积为5μL，流速为0.2mL/min；梯度洗脱：0～1.0min，30％B；1.0～1.5min,30％～50％B；1.5～4.6min,50％B；4.6～4.8min,50％～100％B；4.8～5.3min,100％B；5.3～5.5min,100％～30％B；5.5～8.0min,30％B；质谱条件为：采用ESI-电离模式；检测方式：多反应监测(MRM)；毛细管电压:2.5kV(-)；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：500℃；脱溶剂气流量：1000L/h；碰撞池压力：3.0×10-3mbar。MRM监测模式下液相色谱串联质谱参数如附表1；ESI-离子化模式下3种内标标准溶液的MRM色谱图如附图1-3所示，ESI-离子化模式下8种雌性激素的MRM色谱图如附图4-10所示。作为优选，步骤(1)中，所述内标混合溶液中含有体积比为1:1:1的雌三醇-d3，17β-雌二醇-d3和己烯雌酚-d8。作为优选，步骤(1)中，所述乙腈-乙酸乙酯混合液中乙腈和乙酸乙酯的体积比为1:1。作为优选，步骤(2)和步骤(3)中，所述环己烷-乙酸乙酯混合液中环己烷和乙酸乙酯的体积比为1:1。作为优选，步骤(3)中，所述甲醇/水混合液中甲醇和水的体积比为1:1。因此，本专利技术具有如下有益效果：(1)先用乙腈与乙酸乙酯有效沉淀蛋白，再用涡旋振摇萃取水产品中的雌性激素，萃取效果好，设备要求低，操作简单；(2)采用凝胶渗透色谱净化，净化效果好，有效地降低了萃取液中杂质对液相色谱-串联质谱测定过程的干扰，自动化程度高；(3)采用液相色谱-串联质谱法进行多反应监测，具有较高的灵敏度和精确度；(4)与已有的测试技术相比，方法可同时进行定性及定量测定，操作简单易行，消耗成本低，能够快速分析水产品中的雌性激素。附图说明图1是ESI-离子化模式下雌三醇-d3的MRM色谱图。图2是ESI-离子化模式下17β-雌二醇-d3的MRM色谱图。图3是ESI-离子化模式下己烯雌酚-d8的MRM色谱图。图4是ESI-离子化模式下雌三醇的MRM色谱图。图5是ESI-离子化模式下17α-雌二醇和17β-雌二醇的MRM色谱图。图6是ESI-离子化模式下炔雌醇的MRM色谱图。图7是ESI-离子化模式下雌酮的MRM色谱图。图8是ESI-离子化模式下己烯雌酚的MRM色谱图。图9是ESI-离子化模式下己烷雌酚的MRM色谱图。图10是ESI-离子化模式下己二烯雌酚的MRM色谱图。具体实施方式下面通过具体实施例，并结合附图，对本专利技术的技术方案作进一步具体的说明。在本专利技术中，若非特指，所有设备和原料均可从市场购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。本专利技术采用美国沃特斯公司ACQUITYTMXEVOTQ-MS液相色谱-串联质谱联用仪测定，ImpactVario全自动凝胶净化系统，使用ACQUITYUPLCBEHC18柱(2.1mm×100mm,1.7μm)实现组分分离。实施例1贻贝中内外源性雌性激素的液相色谱串联质谱检测(1)沉淀蛋白：准确称量2.0g匀浆后的贻贝于50mL离心管中，准确加入10μL内标混合溶液(雌三醇-d3、17β-雌二醇-d3、己烯雌酚-d8等比例混合)，避光放置2min，加入6mL的乙腈与乙酸乙酯(1:1，v/v)。加盖振荡混匀3min，沉淀蛋白；(2)涡旋振摇萃取：加入10mL本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种水产品中内外源性雌性激素的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)沉淀蛋白：称量约2.0g匀浆后的水产品于50mL离心管中，准确加入10μL内标混合溶液，避光放置2min，加入6mL的乙腈‑乙酸乙酯混合液；加盖振荡混匀3min，沉淀蛋白；(2)涡旋振摇萃取：加入10mL的乙酸乙酯，涡旋振摇10min后，在4℃下10000r/min离心10min，取上清液转移至玻璃管中，再用5mL的乙酸乙酯重复提取一次，合并上层有机液；在45℃下，氮气吹干，残渣用10.0mL环己烷‑乙酸乙酯混合液溶解，过0.45μm的有机微孔膜，供凝胶色谱净化用；(3)凝胶渗透色谱净化：层析柱：30mm×210mm，填料Bio‑BeadsSX3，中性、多孔的聚苯乙烯‑二乙烯基苯微球体，流动相：环己烷‑乙酸乙酯混合液，流速：5mL/min，进样量：5mL；收集15～26.7min的洗脱液，于45℃下旋至近干后45℃条件下氮气吹干，加入1mL的甲醇/水混合液复溶解，得复溶液；(4)液相色谱‑串联质谱检测：取定容后的复溶液，经0.22μm的有机滤膜过滤到样品小瓶中，进行液相色谱‑串联质谱检测，绘制标准工作曲线，以内标法定量，根据峰面积计算雌性激素的浓度。...
【技术特征摘要】
1.一种水产品中内外源性雌性激素的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)沉淀蛋白：称量约2.0g匀浆后的水产品于50mL离心管中，准确加入10μL内标混合溶液，避光放置2min，加入6mL的乙腈-乙酸乙酯混合液；加盖振荡混匀3min，沉淀蛋白；(2)涡旋振摇萃取：加入10mL的乙酸乙酯，涡旋振摇10min后，在4℃下10000r/min离心10min，取上清液转移至玻璃管中，再用5mL的乙酸乙酯重复提取一次，合并上层有机液；在45℃下，氮气吹干，残渣用10.0mL环己烷-乙酸乙酯混合液溶解，过0.45μm的有机微孔膜，供凝胶色谱净化用；(3)凝胶渗透色谱净化：层析柱：30mm×210mm，填料Bio-BeadsSX3，中性、多孔的聚苯乙烯-二乙烯基苯微球体，流动相：环己烷-乙酸乙酯混合液，流速：5mL/min，进样量：5mL；收集15～26.7min的洗脱液，于45℃下旋至近干后45℃条件下氮气吹干，加入1mL的甲醇/水混合液复溶解，得复溶液；(4)液相色谱-串联质谱检测：取定容后的复溶液，经0.22μm的有机滤膜过滤到样品小瓶中，进行液相色谱-串联质谱检测，绘制标准工作曲线，以内标法定量，根据峰面积计算雌性激素的浓度。2.根据权利要求1所述的一种水产品中内外源性雌性激素的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，步骤(4)中，色谱条件为：采用ACQUITYUPLCBEHC18柱分离；流动相：A相：0.1％氨水；B相：乙腈...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄丽英，张月星，范栋杰，孟春英，
申请(专利权)人：浙江省海洋水产研究所，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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