三金制剂的HPLC特征图谱及其构建方法技术

本发明专利技术属于医药技术领域，具体地说，涉及三金制剂的HPLC特征图谱及其构建方法。所述的HPLC特征图谱包括9个特征峰，其中6号峰为积雪草苷对照峰，其它8个特征峰的相对保留时间为：1号峰0.41，2号峰0.53，3号峰0.13，4号峰0.12，5号峰0.26，7号峰0.14，8号峰0.13，9号峰0.12。本发明专利技术首次建立了三金片正丁醇部位特征图谱，可以在简便条件下同步跟踪检测处方4味主要药味的多个主要成分，全面提升三金制剂的质控标准，提升产品核心竞争力，为确保三金片产品质量和临床疗效稳定奠定坚实基础。此外，该HPLC特征图谱的建立方法可操作性强，重现性好，为更好地控制三金制剂的质量提供了科学依据。

【技术实现步骤摘要】
三金制剂的HPLC特征图谱及其构建方法
本专利技术属于医药
，具体地说，涉及三金制剂的HPLC特征图谱及其构建方法。
技术介绍
三金片由金樱根、积雪草等5味中药组成，具有清热解毒，利湿通淋，益肾功效，主要用于治疗急、慢性肾盂肾炎，膀胱炎及尿路感染等症。三金片作为本申请人独家品种，近年来一直是治疗尿路感染同类中成药的第一品牌，其现行《中国药典》标准包括处方4味药材的薄层鉴别和羟基积雪草苷的含量测定，但尚不能对本品主要物质基础进行整体评价。申请号为200510200471.8的中国专利申请涉及一种治疗泌尿系统等疾病的三金药物制剂及制备方法和质量控制方法。该申请中所涉及的质量控制方法包括(1)金樱根药材、积雪草苷、薯蓣皂苷元的薄层色谱鉴别测试方法；(2)三金制剂中积雪草苷、羟基积雪草苷全部或部分成分的含量测试方法。该方法依旧采用了薄层色谱法(TLCS法)，依旧存在精密度、重现性、稳定性较差，显色不稳定、测定偏差大的不足。针对上述缺陷，申请人于2004年7月2日提出了申请号为200410050066.8的中国专利申请，并授予了专利技术专利权。该专利公开了一种三金制剂的新的质量控制方法，该方法包括含量测定项，含量测定采用的是HPLC-ELSD法。但是，经过系统的分离研究发现，野蔷薇苷与蔷薇苷为金樱根的特征性活性成分，而金樱根又是三金制剂的必须组分，故增加野蔷薇苷与蔷薇苷为控制三金制剂质量的指标成分是十分必要的。而现有的质量标准及质量控制方法均不含野蔷薇苷和/或蔷薇苷含量的测定，可见，现有的质量标准及质量控制方法对三金制剂的质量检测不够全面，对质量控制依旧存在着一定的缺陷，势必存在一定的用药风险。鉴于此，本申请人于2011年1月26日提出了一种新的质量控制方法(申请号为201110028317.2)，该方法在HPLC-ELSD法测定羟基积雪草苷含量的基础上增加了HPLC-ELSD法测定野蔷薇苷和/或蔷薇苷的含量，使三金制剂的质量控制指标更加全面。而对其成分的检测并不能真正反映药材的质量。近年来，特征图谱作为中成药质量标准整体评价模式，在《中国药典》收载中呈上升趋势。因此，目前存在对于能够全面表征三金制剂成分特征的HPLC特征图谱的需求，三金制剂的质量控制方法和质量控制标准有待于进一步完善，为全面提升三金片的质控标准，提升产品核心竞争力，本专利技术在系统研究基础上，系统完成了色谱条件的探索、方法学考察，首次建立了三金片正丁醇部位特征图谱，可以在简便条件下同步跟踪检测处方4味主要药味的多个主要成分，为确保三金片产品质量和临床疗效稳定奠定坚实基础，从而完成了本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种三金制剂的HPLC特征图谱。本专利技术的另一个目的在于提供一种三金制剂的质量检测方法。本专利技术的又一目的在于提供上述HPLC特征图谱的建立方法。本专利技术的再一目的在于提供上述三金制剂的HPLC特征图谱在三金制剂的鉴定、检测中的应用。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：一方面，本专利技术提供了一种三金制剂的HPLC特征图谱，其中，所述的HPLC特征图谱包括9个特征峰，其中6号峰为积雪草苷对照峰，其它8个特征峰的相对保留时间为：1号峰0.41，2号峰0.53，3号峰0.13，4号峰0.12，5号峰0.26，7号峰0.14，8号峰0.13，9号峰0.12。另一方面，本专利技术提供一种三金制剂的质量检测方法，其中，所述的质量检测方法包括将待检测三金制剂的HPLC特征图谱与上述三金制剂的HPLC特征图谱进行比较。具体地说，所述的质量检测方法包括如下步骤：1)使用HPLC法得到待检测三金制剂的HPLC特征图谱，并使用积雪草苷为对照峰，计算各色谱峰的相对保留时间；2)将步骤1)得到的相对保留时间与本专利技术所述的三金制剂的HPLC特征图谱中特征峰相对保留时间比较；3)根据步骤2)的比较结果判断所述待检测三金制剂的质量是否符合标准。又一方面，本专利技术提供所述的三金制剂的HPLC特征图谱的构建方法，其中，所述的HPLC特征图谱的构建方法包括如下步骤：1)色谱条件：C18色谱柱，流动相：乙腈-水-冰醋酸-三乙胺，其中水∶冰醋酸∶三乙胺的体积比为100∶0.1∶0.05，进行梯度洗脱；流速1ml/mim；柱温：23℃；检测波长：210nm；进样量20μl；2)对照品溶液的制备：取积雪草苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.6mg的溶液；3)供试品溶液的制备：取三金制剂，研细，加人甲醇，超声处理，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过；量取续滤液回收溶剂至干，残渣加水溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取，合并正丁醇提取液，用氨试液和水依次洗涤，取正丁醇液，回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解，转移至量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；4)特征图谱构建：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得三金制剂的HPLC特征图谱。三金片正丁醇部位中所含成分较多，曾采用不同浓度的甲醇超声或回流提取再用正丁醇萃取的方式来制备供试品溶液，效果均不佳，最终根据《中国药典》2015年版中三金片供试品溶液制备项下的处理方法以及一系列选择性试验，确定甲醇超声，在正丁醇萃取，正丁醇层用5％氨试液和水各洗涤一次；曾分别用甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲醇-0.5％醋酸铵、乙腈-甲醇-0.5％冰醋酸、乙腈-甲醇-0.2％甲酸、甲醇-水-冰醋酸-三乙胺作为流动相进行梯度洗脱，结果表明甲醇-水-冰醋酸-三乙胺效果最佳；对不同柱温23℃、25℃、30℃、35℃进行筛选，结果表明，低温有助于色谱峰分离(见图8)。最终优化得到本专利技术的色谱条件，在此条件下，各色谱峰分离效果较好，可用于三金片正丁醇部位特征图谱分析。其中，步骤1)中，所述的梯度洗脱按如下程序进行：0min→35min→40min→70min，流动相中乙腈体积浓度变化为20％→26％→28％→34％，流动相中水溶液体积浓度变化为80％→72％→72％→66％。本专利技术采用HPLC梯度洗脱法对三金片正丁醇部位进行研究，建立了三金片正丁醇部位特征图谱，以相对保留时间标定了9个共有峰，用于定性鉴别，实验证明该方法稳定、可靠，为三金片提供一种鉴别样品真伪以及生产企业的质量标准，也对三金片持续的系统基础研究，有较好的技术积累，为确保三金片产品质量和临床疗效稳定奠定坚实基础。上述构建方法中，步骤2)中，对照品溶液的制备为：取积雪草苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.6mg的溶液，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。上述构建方法中，步骤3)中，供试品溶液的制备为：取三金制剂大片20片或小片30片，精密称定，研细，取3g，精密称定，精密加人甲醇30ml，称定重量，超声处理45分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过；精密量取续滤液20ml回收溶剂至干，残渣加水20ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15ml，合并正丁醇提取液，用5％氨试液洗涤1次，每次45ml，再用水洗涤1次，每次45ml，取正丁醇液，减压回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。优选，超声处理功率为250W，频率为40kHz。再一方面，本专利技术提供所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种三金制剂的HPLC特征图谱，其特征在于，所述的HPLC特征图谱包括9个特征峰，其中6号峰为积雪草苷对照峰，其它8个特征峰的相对保留时间为：1号峰0.41，2号峰0.53，3号峰0.13，4号峰0.12，5号峰0.26，7号峰0.14，8号峰0.13，9号峰0.12。

【技术特征摘要】
1.一种三金制剂的HPLC特征图谱，其特征在于，所述的HPLC特征图谱包括9个特征峰，其中6号峰为积雪草苷对照峰，其它8个特征峰的相对保留时间为：1号峰0.41，2号峰0.53，3号峰0.13，4号峰0.12，5号峰0.26，7号峰0.14，8号峰0.13，9号峰0.12。2.一种三金制剂的质量检测方法，其特征在于，所述的质量检测方法包括将待检测三金制剂的HPLC特征图谱与权利要求1所述的三金制剂的HPLC特征图谱进行比较。3.根据权利要求2所述的质量检测方法，其特征在于，所述的质量检测方法包括如下步骤：1)使用HPLC法得到待检测三金制剂的HPLC特征图谱，并使用积雪草苷为对照峰，计算各色谱峰的相对保留时间；2)将步骤1)得到的相对保留时间与权利要求1所述的三金制剂的HPLC特征图谱中特征峰相对保留时间比较；3)根据步骤2)的比较结果判断所述待检测三金制剂的质量是否符合标准。4.权利要求1所述的三金制剂的HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，所述的HPLC特征图谱的构建方法包括如下步骤：1)色谱条件：C18色谱柱，流动相：乙腈-水-冰醋酸-三乙胺，其中水∶冰醋酸∶三乙胺的体积比为100∶0.1∶0.05，进行梯度洗脱；流速1ml/mim；柱温：23℃；检测波长：210nm；进样量20μl；2)对照品溶液的制备：取积雪草苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.6mg的溶液；3)供试品溶液的制备：取三金制剂，研细，加人甲醇，超声处理，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过；量取续滤液回收溶剂至干，残渣加水溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取，合并正丁醇提取液，用氨试液和水依次洗涤，取正丁醇液，回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹节明，周艳林，石媛慧，
申请(专利权)人：桂林三金药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广西,45