一种红景天苷的生物生产方法技术

本发明专利技术公开了一种红景天苷的生物生产方法，包括产红景天苷重组菌的构建和发酵方法。红景天苷重组菌的构建方法为：全化学合成带trc启动子的酮基脱羧酶基因skdc和带tac启动子的糖基转移酶基因sugt2，将skdc基因和sugt2基因整合至SyBE‑002447染色体上，得到SDR1菌株。以葡萄糖为前体，对SDR1菌株进行发酵生产红景天苷。本发明专利技术使用工程大肠杆菌生产红景天苷，可解决红景天苷的来源问题，降低成本。

【技术实现步骤摘要】
一种红景天苷的生物生产方法
本专利技术所属生物医药
，涉及一种产红景天苷的重组菌及构建方法和红景天苷的生物生产方法。
技术介绍
红景天苷(salidroside)，分子式为C14H20O7，分子量为300.30。红景天苷具有良好的抗高原反应、抗氧化、抗辐射、抗疲劳等多种药理活性，被亚欧国家广泛应用于脑缺血、疲劳、缺氧和神经退化性疾病。红景天苷通常从3-5年的野生红景天(Rhodiola)的根中提取，代价很高。因为红景天分布在北半球海拔2500-5500米以上的地区，如阿尔泰山脉、喜马拉雅地区，生长及其缓慢。化学方法合成红景天苷需要进行选择性保护、活化或使用昂贵的金属催化剂，不利于工业生产。
技术实现思路
本专利技术利用一种酮基脱羧酶基因以及一种糖基转移酶基因，在工程大肠杆菌中实现了以葡萄糖等生物质碳源合成红景天苷，使生产成本最低化。本专利技术的第二个目的是提供产红景天苷的重组菌的构建方法。本专利技术的第三个目的是提供产红景天苷的重组菌发酵制备红景天苷的方法。本专利技术的技术方案概述如下：产红景天苷的重组菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：(1)人工全合成带trc启动子的酮基脱羧酶基因skdc，所述序列如SEQIDNo.1所示；人工全合成带tac启动子的糖基转移酶基因sugt2,所述序列如SEQIDNo.2所示；(2)将带trc启动子的skdc基因，通过λ-red同源重组技术整合到大肠杆菌SyBE-002447中，同时敲除feaB基因，得到TRS1菌株；(3)将带trc启动子的sugt2基因，通过λ-red同源重组技术整合到大肠杆菌TRS1菌株中，同时敲除lacI基因，得到SDR1菌株。按上述方法构建产红景天苷的重组菌SDR1菌株。产红景天苷的重组菌SDR1制备红景天苷的方法，其特征是包括如下步骤：将重组菌SDR1菌株接种在LB培养基中，37℃，220rpm，震荡培养2-4h，在OD600到达0.8-1.0之间时，转接到含有葡萄糖的M9培养基中进行发酵36h，生产红景天苷。本专利技术的优点：红景天苷具有抗高原反应、抗氧化、保护心脏等多种药理活性，应用于药品、食品、化妆品品等工业生产中。本专利技术使用工程大肠杆菌，葡萄糖为碳源，利用组成型表达发酵生产红景天苷，微生物合成成本低、产量高。本专利技术可解决红景天苷的来源问题，同时最大限度的降低了生产成本，有利于工业化生产。具体实施方式利用一种酮基脱羧酶基因skdc以及一种糖基转移酶基因sugt2，在工程大肠杆菌中实现了以葡萄糖为生物质碳源合成红景天苷生产成本最低化。原始底盘大肠杆菌是高产酪氨酸的菌株，名称为SyBE-002447，分类命名：大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)。现于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏中心登记入册编号为CGMCCNo.7962。保藏时间为2013年7月22日，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。本专利技术所用pKD46质粒购买自普如汀生物技术(北京)有限公司。LB培养基组成为：10g/LNaCl、10g/L蛋白胨和5g/L酵母粉，余量为水，0.1Mpa压力121℃下灭菌20min。含有葡萄糖的M9培养基组成为：0.5g/LNaCl、1.0g/LNH4Cl、3.0g/LKH2PO4、17.1g/LNa2HPO4·12H2O、0.025％酵母粉，余量为水，培养基在0.1Mpa压力121℃下灭菌20min。灭菌完后加入过膜的终浓度为5mMMgSO4、0.1mMCaCl2以及灭菌的10g/L葡萄糖。下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明。本专利技术设计了红景天苷的人工生物合成途径，详细的合成过程如下：以葡萄糖或者其他生物质为碳源，经过酪氨酸途径合成对羟基苯丙酮酸。对羟基苯丙酮酸在酮基脱羧酶(Skdc)的催化作用下合成4-羟基苯乙醛，4-羟基苯乙醛在大肠杆菌內源乙醇脱氢酶(Adh)催化下生成4-羟基苯乙醇(酪醇)，在糖基转移酶(Sugt2)的催化下，酪醇与UDP-葡萄糖结合合成红景天苷。实施例1酮基脱羧酶基因skdc和糖基转移酶基因sugt2表达盒的设计优选酮基脱羧酶基因，使用JCAT在线密码子优化软件(http：//www.jcat.de)结合OPTIMIZER在线密码子优化工具(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)，以大肠杆菌对密码子的偏好性进行优化，设计全长skdc基因，并在基因前加入trc启动子，构成skdc表达盒，合成序列如SEQIDNo.1示。优选糖基转移酶基因，使用JCAT在线密码子优化软件(http：//www.jcat.de)结合OPTIMIZER在线密码子优化工具(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)，以大肠杆菌对密码子的偏好性进行优化，设计全长sugt2基因，并在基因前加入trc启动子，构成sugt2表达盒，合成序列如SEQIDNo.2示。实施例2λ-red同源重组方法敲除feaB基因同时整合skdc基因到底盘菌株SyBE-002447染色体上。敲除feaB基因同时整合skdc基因到底盘菌株SyBE-002447染色体上的底盘菌株构建过程详细步骤如下：敲除feaB基因同时整合skdc基因到底盘菌株SyBE-002447染色体上的底盘菌株构建过程详细步骤如下：1、整合片段的制备：以KF(SEQIDNO.3)为上游引物，以KR(SEQIDNO.4)为下游引物，以SEQIDNO.1为模板，采用PhantaMaxSuper-FidelityDNA聚合酶，PCR制备KC片段。PCR应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。将得到的KC片段利用PCR产物回收试剂盒纯化回收。2、同源重组：把pKD46质粒导入菌种SyBE-002447，获得SyBE-002447/pKD46，将活化的菌种SyBE-002447/pKD46，接种于10mlLB液体培养基中，30℃，200rpm，培养至OD600为0.4-0.6。加入终浓度为10mML-阿拉伯糖，继续培养3h，4℃下4000rpm离心8min，收集细胞。弃上清，加入冰预冷的10％甘油洗涤细胞2次，制备成电转感受态细胞。取KC片段7.5μL，加入到100μL电转感受态细胞中，轻轻旋转混匀。将混合物加入2mm的冰预冷电击杯中，2.5KV电击4-6ms。然后加入1mLLB培养基，37℃复苏2h后涂布平板，37℃过夜培养。3、整合菌株筛选：挑取单菌落，以TF(SEQIDNO.5)为上引，TR(SEQIDNO.6)为下引，采用TaqDNA聚合酶，进行菌落PCR验证。PCR条带大小约为1900bp时，获得敲除feaB基因同时将skdc基因整合到底盘菌株SyBE-002447染色体上的菌株TRS1/pKD46。菌落PCR应条件为预变性：97℃，5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1.5min，25个循环；72℃延伸5min；4℃保存。4、缺失pKD46：挑取PCR验证正确单菌落，在42℃下无抗生素的平板上连续传代3次。在氨苄青霉素抗性平板和无抗性平板上同时接种，氨苄青霉素抗性平板不生长，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产红景天苷的重组菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：(1)人工全合成带trc启动子的酮基脱羧酶基因skdc，所述序列如SEQ ID No.1所示；人工全合成带trc启动子的糖基转移酶基因sugt2，所述序列如SEQ ID No.2所示；(2)将带trc启动子的skdc基因，通过λ‑red同源重组技术整合到大肠杆菌SyBE‑002447中，同时敲除feaB基因，得到TRS1菌株；(3)将带trc启动子的sugt2基因，通过λ‑red同源重组技术整合到大肠杆菌TRS1菌株中，同时敲除lacI基因，得到SDR1菌株。

【技术特征摘要】
1.一种产红景天苷的重组菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：(1)人工全合成带trc启动子的酮基脱羧酶基因skdc，所述序列如SEQIDNo.1所示；人工全合成带trc启动子的糖基转移酶基因sugt2，所述序列如SEQIDNo.2所示；(2)将带trc启动子的skdc基因，通过λ-red同源重组技术整合到大肠杆菌SyBE-002447中，同时敲除feaB基因，得到TRS1菌株；(3)将带trc启动子的su...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵广荣，刘雪，李玲玲，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12