A或B亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白及其纯化方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种A或B亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白及其纯化方法和应用，包括下列步骤：（1）设计并合成扩增gp85基因的特异性引物；（2）PCR扩增获得gp85基因片段并纯化；将ALV‑A/B的gp85基因分别克隆至pET‑32a原核表达载体，筛选阳性克隆后测序鉴定；（4）重组表达载体pET‑32a‑A/B‑gp85的表达；（5）尿素法纯化表达的gp85蛋白；（6）重组gp85蛋白的复性。利用本发明专利技术的方法获得了高纯度的可溶性gp85蛋白。表达的蛋白可作为包被抗原建立抗体检测方法，还可用于免疫动物制备抗血清，为免疫荧光、免疫组化等提供原材料。

【技术实现步骤摘要】
A或B亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白及其纯化方法和应用
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种A或B亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白及其纯化方法和应用。
技术介绍
禽白血病（AL）是由禽白血病病毒（ALV）肉瘤病毒群病毒引起的禽类多种良性和恶性肿瘤性疾病，临床上多以免疫抑制、生长抑制和多器官组织出现肿瘤等为主要特征。根据宿主范围、囊膜蛋白抗原性和交叉中和反应等，将其分为Ａ-Ｋ共11个亚群，其中Ａ-Ｄ、Ｊ和Ｋ亚群为外源性ALV。Ｃ、Ｄ亚群在野外很少见，Ｅ-I亚群为内源性ALV，而Ｆ-Ｉ亚群主要感染野生禽类。外源性ALV中，A、B和J亚群对鸡有明显的致病性，对养禽业生产的危害也较大。由于我国地域广阔、养殖环境复杂、病毒不断变异，给ALV的净化带来了极大的困难。近几年在我国鸡群、尤其地方品系中又分离到了ALV-A、ALV-B。当前有针对ALV-A/B的ELISA抗体检测试剂盒，但只用于检测鸡群中ALV-A/B的抗体水平，并不能判断鸡群中现在是否还有ALV-A/B的感染。我国开展血清学监测通常使用美国等公司的ELISA检测试剂盒，检测成本高、推广范围窄。根据国外毒株研制的检测方法和试剂盒不能够准确的检测到国内鸡群的感染状况，因此建立适用的ALV-A/B检测体系对ALV净化显的尤为重要。ALV-A/B囊膜糖蛋白中的表面蛋白gp85含有许多抗原表位，是制备区分病毒亚群的特异性抗体的首选蛋白。如何应用ALV-A/B分离毒株的重组gp85蛋白进行原核表达并纯化得到纯度高可溶性好的gp85蛋白，是本专利技术要解决的技术问题。
技术实现思路
本专利技术就是针对上述存在的缺陷而提供一种A或B亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白及其纯化方法，应用ALV-A/B分离毒株的重组gp85蛋白进行原核表达并利用尿素法纯化得到的包涵体蛋白，通过透析复性得到了纯度高可溶性好的gp85蛋白。表达的蛋白可作为包被抗原建立抗体检测方法，还可用于免疫动物制备抗血清，为免疫荧光、免疫组化等提供原材料。同时，利用单克隆抗体技术制备抗蛋白的单克隆抗体，为今后对该病毒的临床诊断和抗原检测试剂盒的开发提供物质基础。本专利技术的A或B亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白技术方案为，一种A或B亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白纯化方法，包括以下步骤：（1）设计扩增ALV-A/Bgp85基因的特异性引物；（2）PCR扩增获得gp85基因片段并纯化；（3）将ALV-A/B的gp85基因分别克隆至pET-32a原核表达载体，筛选阳性克隆后测序鉴定；（4）重组表达载体pET-32a-A/B-gp85的表达；（5）尿素法纯化表达的gp85蛋白；（6）重组gp85蛋白的复性。步骤（1）中，ALV-A/B-F：5’-CGGGATCCGCTGATGTTCACTTACTCG-3’（加粗代表保护碱基，斜体为BamHⅠ酶切位点）ALV-A/B-R：5’-CCCAAGCTTTTATCGTTTATGTCTTACCCCTG-3’（加粗代表保护碱基，斜体为HindⅢ酶切位点，下划线为终止密码子）。步骤（3）中，gp85基因片段及pET-32a空载体分别用BamHⅠ、HindⅢ快速内切酶进行双酶切，37℃温浴15min，纯化双酶切后的目的基因和载体片段，配置10μL连接体系，4℃反应过夜；连接产物转化E.coliRosetta(DE3)感受态，涂氨苄青霉素LB平板后，37℃温箱孵育过夜；挑取LB平板上单个的白色菌落，接种于5mL含Amp的LB液体培养基中，37℃培养10h，提取质粒。步骤（4）中，蛋白表达过程中表达条件：37℃，摇床转速为160rpm，终浓度为0.1mM的IPTG，诱导5h。步骤（5）中，用溶液1重悬菌体，超声波冰浴裂解，再依次通过溶液2、溶液3、溶液4洗涤，溶液5溶解包涵体，装入处理过的透析袋中，以TEbuffer溶解的4M尿素溶液为初始透析液，通过逐渐稀释透析液的方法使透析袋中的尿素浓度依次降低，至袋中尿素浓度为零时收获复性蛋白；溶液1：50mmol/LTris-Hcl（pH=8.0），1mmol/LEDTA（pH=8.0），100mmol/LNaCl；溶液2：500mmol/LTris-Cl（pH=8.0），100mmol/LNaCl，1mmol/LEDTA，0.5%TritonX-100；溶液3：溶液2含2M尿素；溶液4：溶液2含4M尿素；溶液5：溶液2含8M尿素。所要表达的ALV-A-gp85基因编码的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示：IGIPSPISEGDFKGYVSDNCTTLGTDRLVSSASITGGPDNSTTLTYRKVSCLLLKLNVSMWDEPPELQLLGSQSLPNITDITQISGVAGGCVGFRPKGVPWYLGWSQGEATRFLLRHPSFSNLTEPFTVVTADRHNLFMGSEYCGAYGYRFWEIYNCSQEGQQYRCGKARRPRPQSPETQCTRQGGIWVNRSKEINETEPFSFTVNCTASNLGNASGCCGKAGTILPGIWVDSTQGNFTKPKALPPGIFLICGDRAWQGIPSRPVGGPCYLGKLTMLAPNHTDILKILANSSQTGVRHKR；ALV-B-gp85基因编码的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示：ADVHLLEQPGNLWITWANRTGQTDFCLSTQSATSPFQTCLIGIPSPISEGDFKGYVSGNCTALGTHRLVSSGIHGGPDNSTTLTYRKVSCLLLKLNVSLLDEPSELQLLGSQSLPNITNITQIPSVAGGCIGFTPYGSPAGVYGWDRRQVTHILLTDPGSNPFFNKASNSSKPFTVVTADRHNLFMGSEYCGAYGYRFWEMYNCSQMRQNWSICMDVWGRGLPESWCTSTGGIWVNQSKEINETEPFSFTANCTGSNLGNVSGCCGESITILPPGAWVDSTQGSFTKPKALPPGIFLICGDRAWQGIPSRPVGGPCYLGKLTMLAPNHTDILKILANSSQTGVRHKR。所述的纯化方法得到的A或B亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白。所述的A或B亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白在检测A或B亚群禽白血病病毒上的应用。所述的A或B亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白在制备A或B亚群禽白血病病毒抗体上的应用。本专利技术的有益效果为：（1）利用大肠杆菌为表达宿主菌，其结构简单，生长速度快，易于培养和发酵，有效降低了生产成本。表达量高且表达条件易于标准化适用于规模化生产。（2）纯化试剂主要为不同浓度的尿素溶液，价格低廉，操作简单，纯化后的蛋白纯度高。（3）gp85蛋白是病毒囊膜表面的主要抗原，表达的蛋白可作为包被抗原建立抗体检测方法，还可用于免疫动物制备抗血清，为免疫荧光、免疫组化等提供原材料。该专利技术提供的包涵体蛋白纯化及变复性方法为相关单位进行gp85蛋白的原核表达提供了方法。（4）实验表明，本专利技术的方法可用于A/B亚群禽白血病病毒不同毒株gp85蛋白的表达和纯化。附图说明：图1所示为实施例1获本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种A或B亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）设计扩增ALV‑A/B gp85基因的特异性引物；（2）PCR扩增获得gp85基因片段并纯化；（3）将ALV‑A/B 的gp85基因分别克隆至pET‑32a原核表达载体，筛选阳性克隆后测序鉴定；（4）重组表达载体pET‑32a‑A/B‑gp85的表达；（5）尿素法纯化表达的gp85蛋白；（6）重组gp85蛋白的复性。

【技术特征摘要】
1.一种A或B亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）设计扩增ALV-A/Bgp85基因的特异性引物；（2）PCR扩增获得gp85基因片段并纯化；（3）将ALV-A/B的gp85基因分别克隆至pET-32a原核表达载体，筛选阳性克隆后测序鉴定；（4）重组表达载体pET-32a-A/B-gp85的表达；（5）尿素法纯化表达的gp85蛋白；（6）重组gp85蛋白的复性。2.根据权利要求1所述的A或B亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白纯化方法，其特征在于，步骤（1）中，ALV-A/B-F：5’-CGGGATCCGCTGATGTTCACTTACTCG-3’ALV-A/B-R：5’-CCCAAGCTTTTATCGTTTATGTCTTACCCCTG-3’。3.根据权利要求1所述的A或B亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白纯化方法，其特征在于，步骤（3）中，gp85基因片段及pET-32a空载体分别用BamHⅠ、HindⅢ快速内切酶进行双酶切，37℃温浴15min，纯化双酶切后的目的基因和载体片段，配置10μL连接体系，4℃反应过夜；连接产物转化E.coliRosetta(DE3)感受态，涂氨苄青霉素LB平板后，37℃温箱孵育过夜；挑取LB平板上单个的白色菌落，接种于5mL含Amp的LB液体培养基中，37℃培养10h，提取质粒。4.根据权利要求1所述的A或B亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白纯化方法，其特征在于，步骤（4）中，表达条件为：37℃，摇床转速为160rpm，终浓度为0.1mM的IPTG，诱导5h。5.根据权利要求1所述的A或B亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白纯化方法，其特征在于，步骤（5）中，用溶液1重悬菌体，超声波冰浴裂解，再依次通过溶液2、溶液3、溶液4洗涤，溶液5溶解包涵体，装入处理过的透析袋中，以TEbuffer溶解的4M尿素溶液为初始透析液，通过逐渐稀释透析液的方法使透析袋中的尿素浓度依次降低，至袋中尿素浓度为零时收获复性蛋白；溶液1：50mmol/LTris-Hcl，pH=8.0，1mmol/LEDTA，pH=8.0，100mmol/LNaCl；溶液2：500mmol/LTris-Cl，pH=8.0，100mmol/LNaCl，1mmol/LE...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐晴晴，王峰，沈志强，
申请(专利权)人：山东省滨州畜牧兽医研究院，
类型：发明
国别省市：山东,37