一种单采血小板制品中残留细胞的检测方法技术

本案涉及一种单采血小板制品中残留细胞的检测方法，包括：步骤1)取细胞样本，加入染色抗体试剂，完成细胞特异性标记；步骤2)将细胞样本平铺后，通过荧光显微镜进行观察计数；其中，所述染色抗体试剂包括有：实现对血小板染色的以

【技术实现步骤摘要】
一种单采血小板制品中残留细胞的检测方法
本专利技术涉及血小板制品检测领域，特别涉及一种单采血小板制品中残留细胞的检测方法。
技术介绍
目前，血小板输血是目前血小板减少症和多种疾病的最主要治疗手段之一，已发展成为仅次于红细胞输血的临床第二大成分输血。但是，血小板输注无效事件仍频频发生，血液病人一般需要多次输注血小板，多次输注血小板后很容易出现输注无效，究其原因主要是产生了同种异型的抗体，研究表明，大部分血小板输注无效病人体内存在HLA抗体、HPA抗体和ABH抗体，其中80％患者存在HLA抗体。抗体产生的主要原因很大可能是由多次及不同供血者供应的血小板中残留的白细胞及红细胞刺激病人免疫系统产生的。因此，从源头提高血小板制品的质量，对血小板制品实施严格的质量监测，尤其是对血小板中白细胞残留量进行严格检测，避免白细胞及红细胞残留引起的输血无效，保证血小板制品的安全性，成为临床亟待解决的首要问题。血小板制品的质量控制，国际以及国内标准均有明确需求，依据标准GB18469-2012全血及成分血质量要求，去白细胞单采血小板中白细胞混入量要求低于5×106个/袋，红细胞混入量低于8×109个/袋，这是血站日常质控项目之一。现有血小板制品中的混入细胞检测方法主要参考标准WST550-2017全血及成分血质量监测指南及《全国临床检验操作规程》要求。混入红细胞计数仍使用经典的显微镜法，而白细胞同样可采用经典的血细胞计数盘或者运用血细胞分析仪计数。近年来，虽然有些血站采用更为精准的流式细胞仪分析，但流式技术相对的样本制备繁琐，并且对操作人员的要求较高，价格高昂，因此不具有普遍适用性。当前残留细胞检测方法问题较多，局限性较大。基于大容量Nageotte血细胞计数盘的人工计数方式，其误差大、重复性差、无原始记录，不符合现代对记录保存及证据链的要求。市场上的常规血细胞计数仪很难做到对单采血小板产品中相关指标特别是残留白细胞及红细胞进行精确计数。常用细胞计数方法(如血细胞计数仪、流式细胞仪等)的检测底限一般在104个/mL左右，无法对去白单采血小板中残留细胞进行快速、有效的检测。
技术实现思路
针对现有技术中的不足之处，本专利技术提供了一种单采血小板制品中残留细胞的检测方法，以期通过细胞染色标记、荧光成像相结合的方法，实现对多类细胞的同时精确检测，如若再结合细胞成像与数据处理，可实现血小板制品中残留白细胞、残留红细胞及血小板含量的一次性高速精准判读。为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：一种单采血小板制品中残留细胞的检测方法，其包括：步骤1)取细胞样本，加入染色抗体试剂，完成细胞特异性标记；步骤2)将细胞样本平铺后，通过荧光显微镜进行观察计数；其中，所述染色抗体试剂包括有：实现对血小板染色的以Alexa488标记的CD41和CD61；实现对白细胞染色的以Alexa594标记的CD45；以及实现对白细胞核染色的细胞核染料。优选的是，所述的检测方法，其中，CD41和CD61的浓度比为1∶6.7-6.9。优选的是，所述的检测方法，其中，CD41和CD61的浓度比为1∶6.8。优选的是，所述的检测方法，其中，所述细胞核染料的结构式为：优选的是，所述的检测方法，其中，所述细胞核染料中，R1为COOEt或CH3或H。优选的是，所述的检测方法，其中，所述细胞核染料中，R2为CH3或CH2CH3或H。优选的是，所述的检测方法，其中，所述细胞核染料中，R3为CH3或CH2CH3或H。优选的是，所述的检测方法，其中，所述细胞核染料中，R1为COOEt；R2为CH3；R3为CH2CH3。本专利技术的有益效果是：本案通过采用细胞染色标记与荧光成像相结合的手段，可实现残留白细胞、红细胞和血小板的同时检测；后期可适配荧光显微镜与软件计算，实现自动检测与计数；操作简单，效率高。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为用于荧光检测的微孔载体芯片的结构示意图。图2为实施例1的细胞大小图。图3为实施例1的血小板荧光成像图。图4为实施例1的白细胞荧光成像图。图5为实施例1的白细胞核荧光成像图。图6为对比例1的白细胞核荧光成像图。具体实施方式下面将结合附图对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。此外，下面所描述的本专利技术不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。实施例一、材料1.细胞样本；2.荧光染料：CD41(GeneTex公司，货号GTX113758)，CD61(武汉博欧特，货号orb86360)，CD41和61均用Alexa488(ThermoFisher公司)标记；CD45(上海研卉，货号11-0451-82)，用Alexa594(ThermoFisher公司)标记；细胞核染料：R1为COOEt或CH3或H；R2为CH3或CH2CH3或H；R3为CH3或CH2CH3或H。其合成方法如下(以R1为COOEt；R2为CH3；R3为CH2CH3为例)：总收率：17.5％。1HNMR(400MHz,氘代DMSO):δ8.41(s,1H,ArH),7.91(s,1H,ArH),7.59(s,1H,ArH),7.23(s,2H,ArH),7.21(s,2H,ArH),4.38(m,2H,NHCH2),4.30(m,2H,COOCH2CH3),4.01(s,1H,NHCH2),3.90(m,1H,C＝NH),3.76(m,1H,HCl),3.35(m,2H,NCH2CH3),3.01(s,3H,NCH3),1.29(s,3H,COOCH2CH3),1.12(s,3H,NCH2CH3)。3.细胞固定液：4％PFA：4％多聚甲醛(PBS溶解)：其为细胞固定剂，用于防裂解。或者用戊二醛或甲醛或冰乙醇(-20℃预冷)的PBS溶液替代；4.细胞膜通透剂：0.1-0.5％TritonX100，便于细胞核染料进入细胞；5.5％小牛血清，用于封闭抗体非特异性结合位点；甘油：细胞膜稳定剂，1-10％；6.细胞湿润剂：1％BSA(牛血清白蛋白)溶液(PBS溶解)。二、实验步骤1.取细胞样本于600rpm离心，PBS洗涤2次。2.向细胞沉淀中加入1ml细胞固定液，37℃孵育10min。600rpm离心5min，去除上清。3.细胞沉淀用1ml0.1％TritonX100(PBS溶解)重悬，室温、孵育5-15min。600rpm离心5min，去除上清。4.细胞沉淀用1ml5％小牛血清加1％甘油，封闭30min，室温。600rpm离心5min，去除上清。5.细胞沉淀用0.5mlPBS重悬，加入5ul0.5mg/ml的Alexa488-CD41/61抗体(CD41和CD61的浓度比为1∶6.7-6.9)和Alexa594-CD45抗体，室温作用15-30min。6.加入细胞核染本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单采血小板制品中残留细胞的检测方法，其特征在于，包括：步骤1)取细胞样本，加入染色抗体试剂，完成细胞特异性标记；步骤2)将细胞样本平铺后，通过荧光显微镜进行观察计数；其中，所述染色抗体试剂包括有：实现对血小板染色的以

【技术特征摘要】
1.一种单采血小板制品中残留细胞的检测方法，其特征在于，包括：步骤1)取细胞样本，加入染色抗体试剂，完成细胞特异性标记；步骤2)将细胞样本平铺后，通过荧光显微镜进行观察计数；其中，所述染色抗体试剂包括有：实现对血小板染色的以488标记的CD41和CD61；实现对白细胞染色的以594标记的CD45；以及实现对白细胞核染色的细胞核染料。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，CD41和CD61的浓度比为1∶6.7-6.9。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，CD41和CD61的...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡佳，
申请(专利权)人：苏州叠代生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32