一种简便快速检测牡蛎倍性的方法技术

本发明专利技术公开了一种简便快速检测牡蛎倍性的方法；首先在牡蛎两壳间靠近闭壳肌的边缘处，用尖嘴钳捏碎贝壳边缘，形成一条2‑3㎜的缝隙，然后用一次性注射器通过该缝隙，插入闭壳肌血淋巴窦内抽取血淋巴，血淋巴经无水乙醇固定后，离心倒掉上清液，然后加入PBS重新悬浮，再依次经RNA酶反应、PI染色。最后经300目筛绢过滤后，使用流式细胞仪检测DNA含量，确定倍性。本发明专利技术提供的通过抽取牡蛎闭壳肌血淋巴窦内的血淋巴进行倍性检测的方法，具有非致死、简便快速、不受牡蛎生活环境制约等优点，对于牡蛎多倍体育种研究，特别是对活体牡蛎多倍体的倍性检测和后续深入研究具有重要的意义。

A Simple and Rapid Method for Detecting Ploidy of Oysters

The invention discloses a simple and rapid method for detecting the ploidy of oysters. Firstly, at the edge of the closure muscle between the shells of oysters, the edge of the shell is crushed with a pointed-mouth forceps to form a 2_3_gap, and then the hemolymph is extracted through the gap by inserting a disposable injector into the blood lymphatic sinus of the closure muscle, and the hemolymph passes through anhydrous B. After alcohol immobilization, the supernatant was centrifuged and then suspended with PBS, followed by RNA enzyme reaction and PI staining. Finally, after 300 mesh silk filtration, DNA content was detected by flow cytometry to determine ploidy. The method provided by the invention for ploidy detection by extracting the hemolymph from the hemolymph sinus of oyster closure muscle has the advantages of non-lethality, simplicity and rapidity, and is not restricted by the living environment of oyster. It is important for the research of oyster polyploidy breeding, especially for the ploidy detection of living oyster polyploidy and further research. Significance.

【技术实现步骤摘要】
一种简便快速检测牡蛎倍性的方法
本专利技术属于贝类多倍体检测
，具体涉及一种非致死、简便快速检测牡蛎倍性的方法。
技术介绍
牡蛎多倍体育种研究一直是海产经济贝类遗传育种的一个热点。相对于普通牡蛎二倍体而言，牡蛎多倍体具有不可替代的优势。牡蛎三倍体，可以全年供应市场，解决了牡蛎二倍体因夏季体内糖原含量大量消耗而导致的口感变差，难以供应市场的难题，而且三倍体还具有生长速度快和品质好等优点，受到广大消费者的喜爱和牡蛎养殖业的推崇，已经形成了产业化，具有非常广阔的发展前景。但是牡蛎三倍体可育性差，甚至理论上来说是不育的，存在不能自我延续种群、直接诱导率无法达到100%以及存活率低等问题，因此，鉴于三倍体重要的经济价值，牡蛎四倍体的研究显得更加重要。牡蛎四倍体的价值体现在不仅可以和二倍体杂交获得100%三倍体后代，而且四倍体能够自我延续种群、扩大种群规模以及保持良种种质。因此获得存活的牡蛎四倍体对于牡蛎三倍体育种和规模化生产是至关重要的。在牡蛎多倍体的研究过程中，对牡蛎进行倍性检测是必不可少的步骤。如何在保证牡蛎存活的情况下，进行简单快速的倍性检测仍存在较大的困难。目前，存在的致死性的牡蛎倍性检测方法如解剖取鳃或其它组织的方法，不可避免造成珍贵实验样品的损失，无法进行后续的实验研究。一种利用牡蛎体腔液中淋巴细胞检测牡蛎的倍性的方法（专利号201510194867.X，李军等，2015），能够无损伤的进行提取粘液，但是其操作环境需要在海水中并且需要牡蛎自然张开双壳时才能进行，不能满足实验随时取样检测倍性的需求；并且张口取其抽取体腔液中的血淋巴，其内成分比较复杂，易抽到体腔中水及杂质等，无法保证准确抽取到单一的血淋巴，操作的同时刺激牡蛎马上闭壳，造成针头夹住无法取样或不能拔出针头等问题。即，该专利方法在实际操作中并不实用。因此，牡蛎多倍体育种研究迫切需要一种操作简便、不受取样环境制约且非致死的倍性检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种简便快速检测牡蛎倍性的方法，以弥补现有技术的不足。为达到上述目的，本专利技术采取的具体技术方案的操作步骤为：一种简便快速检测牡蛎倍性的方法，包括以下步骤：（1）在待检测的牡蛎两壳间靠近闭壳肌的边缘处，使贝壳边缘形成缝隙，缝隙的长度要便于插入注射器和确定闭壳肌的位置；（2）根据倍性检测需要和降低对检测样品刺激的原则，抽取闭壳肌血淋巴窦内的血淋巴；（3）将抽取的血淋巴滴入到无水乙醇中进行固定，放置后，使血淋巴细胞固定完全；（4）将固定的血淋巴细胞离心去掉上清液；（5）重新悬浮得到悬浮液，并去除RNA干扰；（6）染色；（7）检测倍性。进一步的，所述步骤（1）中用尖嘴钳捏碎贝壳边缘形成一条2~3㎜的缝隙。进一步的，所述步骤（2）具体为，用1.5mL的一次性注射器插入闭壳肌血淋巴窦内抽取血淋巴，抽取100~200mL。进一步的，所述步骤（3）具体为，将抽取的血淋巴逐滴滴入到-20℃预冷的无水乙醇中进行固定，乙醇最终浓度为75%，然后4℃放置一段时间，使血淋巴细胞固定完全。进一步的，所述步骤（4）中，离心力不超过300g，以避免离心力过大造成血淋巴细胞破碎。进一步的，所述步骤（5）具体为，加入1mL磷酸盐缓冲液(PBS)重新悬浮，再加入1mgRNA酶A反应30min，去除RNA，以避免RNA干扰。进一步的，所述步骤（6）具体为：所述向悬浮液中加入35mg碘化丙啶（PI），染色30min。进一步的，所述步骤（7）具体为：所述经300目筛绢过滤后，流式细胞仪检测DNA含量，确定倍性。再上述抽取完血淋巴后，将检测个体继续养成，以便统计存活率。本专利技术的优点和技术效果：本专利技术具有取样方法简单、不受牡蛎生活环境制约以及非致死等优点。本专利技术取样后，损伤的贝壳、牡蛎等可通过分泌次生壳进行修复，并不影响其后期正常生长和存活。本专利技术解决了牡蛎多倍体倍性检测过程中操作繁琐以及容易致死的问题，为牡蛎倍性检测提供了一种行之有效的方法。具体实施方式以下通过具体实施例对本专利技术进一步解释和说明。实施例1：（1）取30个壳高为6~10cm的普通长牡蛎。（2）在待检测的牡蛎两壳间靠近闭壳肌的边缘处，用尖嘴钳捏碎贝壳边缘形成一条2~3㎜的缝隙。（3）用1.5ml的一次性注射器通过缝隙插入闭壳肌肌肉窦内，抽取100~200mL血淋巴。（4）将抽取的血淋巴逐滴滴入到-20℃预冷的无水乙醇中进行固定，4℃过夜。（5）将固定的血淋巴细胞离心去掉上清液后，加入1mL1×PBS重新悬浮，再加入1mgRNA酶A反应30min。（6）然后再加入35mgPI，染色30min。（7）经300目筛绢过滤后，流式细胞仪检测DNA含量，确定倍性。（8）检测后的个体转移到养殖海区继续养成，三个月后统计存活率。倍性检测结果显示：普通长牡蛎30个个体全部为二倍体。存活率统计结果表明，普通长牡蛎的30个个体全部存活，存活率为100%。实施例2：（1）从威海荣成养殖海区取壳高为3~4cm、左右壳和外套膜均为金黄色的长牡蛎“海大2号”新品种三倍体实验诱导组，数目为45个。（2）在待检测的牡蛎两壳间靠近闭壳肌的边缘处，用尖嘴钳捏碎贝壳边缘形成一条2~3㎜的缝隙。（3）用1.5ml的一次性注射器通过缝隙插入闭壳肌肌肉窦内，抽取100~200mL血淋巴。（4）将抽取的血淋巴逐滴滴入到-20℃预冷的无水乙醇中进行固定，4℃过夜。（5）将固定的血淋巴细胞离心去掉上清液后，加入1mL1×PBS重新悬浮，再加入1mgRNA酶A反应30min。（6）然后再加入35mgPI，染色30min。（7）经300目筛绢过滤后，流式细胞仪检测DNA含量，确定倍性。（8）检测后的个体转移到养殖海区继续养成，三个月后统计存活率。倍性检测结果显示：长牡蛎“海大2号”新品种三倍体实验诱导组45个个体中：二倍体27个，三倍体18个。存活率统计结果表明，长牡蛎“海大2号”新品种三倍体实验诱导组的45个个体全部存活，存活率为100%。实施例3：（1）从威海荣成养殖海区取壳高为3~4cm、本实验室选育的左右壳均为黑色的长牡蛎新品系三倍体实验诱导组，数目为50个。（2）在待检测的牡蛎两壳间靠近闭壳肌的边缘处，用尖嘴钳捏碎贝壳边缘形成一条2~3㎜的缝隙。（3）用1.5ml的一次性注射器通过缝隙插入闭壳肌肌肉窦内，抽取100~200mL血淋巴。（4）将抽取的血淋巴逐滴滴入到-20℃预冷的无水乙醇中进行固定，4℃过夜。（5）将固定的血淋巴细胞离心去掉上清液后，加入1mL1×PBS重新悬浮，再加入1mgRNA酶A反应30min。（6）然后再加入35mgPI，染色30min。（7）经300目筛绢过滤后，流式细胞仪检测DNA含量，确定倍性。（8）检测后的个体转移到养殖海区继续养成，三个月后统计存活率。倍性检测结果显示：长牡蛎壳黑品系三倍体实验诱导组50个个体中：二倍体33个，三倍体17个。存活率统计结果表明，长牡蛎壳黑品系三倍体实验诱导组的50个个体全部存活，存活率为100%。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种简便快速检测牡蛎倍性的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1）在待检测的牡蛎两壳间靠近闭壳肌的边缘处，使贝壳边缘形成缝隙，缝隙的长度要便于插入注射器和确定闭壳肌的位置；（2）根据倍性检测需要和降低对检测样品刺激的原则，抽取闭壳肌血淋巴窦内的血淋巴；（3）将抽取的血淋巴滴入到无水乙醇中进行固定，放置后，使血淋巴细胞固定完全；（4）将固定的血淋巴细胞离心去掉上清液；（5）重新悬浮得到悬浮液，并去除RNA干扰；（6）染色；（7）检测倍性。

【技术特征摘要】
1.一种简便快速检测牡蛎倍性的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1）在待检测的牡蛎两壳间靠近闭壳肌的边缘处，使贝壳边缘形成缝隙，缝隙的长度要便于插入注射器和确定闭壳肌的位置；（2）根据倍性检测需要和降低对检测样品刺激的原则，抽取闭壳肌血淋巴窦内的血淋巴；（3）将抽取的血淋巴滴入到无水乙醇中进行固定，放置后，使血淋巴细胞固定完全；（4）将固定的血淋巴细胞离心去掉上清液；（5）重新悬浮得到悬浮液，并去除RNA干扰；（6）染色；（7）检测倍性。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中用尖嘴钳捏碎贝壳边缘形成一条2~3㎜的缝隙。3.如权利要求1所述的所述方法，其特征在于，所述步骤（2）具体为，用1.5mL的一次性注射器插入闭壳肌血淋巴窦内抽取血淋巴，抽取100~200mL。4.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：李永国，李琪，于瑞海，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东,37