本发明专利技术公开了一种类芽胞杆菌菌株HB172198，该菌株HB172198的分类命名为类芽胞杆菌(Paenibacillus sp.)，保藏编号为：CGMCC No.15412，保藏日期为：2018年03月05日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。本发明专利技术还公开了一种褐藻胶裂解酶及其制备方法，以及上述类芽胞杆菌菌株HB172198和褐藻胶裂解酶在降解褐藻中的应用。
A Bacillus-like strain HB172198 and its application
The invention discloses a Bacillus-like strain HB172198, which is classified as Paenibacillus sp. and its storage number is CGMCC No. 15412. The storage date is March 05, 2018. The storage unit is the General Microbial Center of China Microbial Species Preservation and Management Commission, and the storage address is as follows: For: Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, No. 3, 1 Beichen West Road, Chaoyang District, Beijing. The invention also discloses a alginate lyase and a preparation method thereof, as well as the application of the above-mentioned bacillus-like strain HB172198 and alginate lyase in the degradation of brown algae.
【技术实现步骤摘要】
一种类芽胞杆菌菌株HB172198及其应用
本专利技术属于微生物
，具体涉及一种类芽胞杆菌菌株HB172198及其应用。
技术介绍
褐藻胶，又名海藻酸钠，是由1,4-β-D-甘露糖醛酸(1,4-β-D-mannuronicacid，M)和1,4-α-L-古罗糖醛酸(1,4-α-L-guluronicacid，G)两种糖醛酸单体通过α/β-1,4糖苷键链接、随机排列成的线性高分子，广泛存在于海带、马尾藻、巨藻、鹿角菜等褐藻的细胞中。褐藻胶作为一种极具应用价值的多糖类物质，可以被降解成由2～20个单糖聚合而成的寡糖片段，从而表现出多种生物活性，在食品、医疗及工业生产等行业应用广泛。褐藻胶的降解方法分为化学降解法、物理降解法和酶降解法。其中，酶解法是通过褐藻胶裂解酶将大分子褐藻胶降解成小分子的寡糖片段，反应条件温和、效率高、底物专一性强，不会产生对人体和环境有害的副产物，逐渐成为工业降解褐藻胶生产褐藻寡糖的主要手段。自然界中褐藻胶裂解酶的来源广泛，可以从多种海洋动物、海洋和陆地微生物体内分离得到，其中微生物是产生褐藻胶裂解酶的主要类群。微生物中又以细菌产酶能力较强且研究较多，如弧菌属(Vibrio)、假单胞菌属(Pseudomonas)、盐单胞菌属(Halomonas)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、黄杆菌属(Flavobacterium)和芽胞杆菌(Bacillus)等，其中绝大多数是革兰氏阴性菌，而革兰氏阳性菌的报道极少。芽胞杆菌具有适应能力强、生长速度快、存活时间长等特点，目前报道的产褐藻胶裂解酶的芽胞杆菌较少。芽胞杆菌产生的褐藻胶裂解酶可以作用于特定的糖苷键，形成较固定的产物，有着广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种类芽胞杆菌菌株HB172198，该菌株能够有效降解褐藻胶，还可作为一种新的褐藻胶裂解酶产生菌，也可直接用于褐藻生物降解的微生物资源。本专利技术的目的还在于提供一种褐藻胶裂解酶及其制备方法，该褐藻胶裂解酶能有效降解褐藻胶，该方法工艺成熟，能获得大量的褐藻胶裂解酶。本专利技术的第三个目的在于提供上述类芽胞杆菌菌株HB172198及褐藻胶裂解酶在降解褐藻胶中的应用。本专利技术的上述第一个目的是通过以下技术方案来实现的：一种类芽胞杆菌菌株HB172198，该菌株HB172198的分类命名为类芽胞杆菌(Paenibacillussp.)，保藏编号为：CGMCCNo.15412，保藏日期为：2018年03月05日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。本专利技术中的类芽胞杆菌HB172198属于细菌域、厚壁菌门、芽胞杆菌纲、芽胞杆菌目、类芽胞杆菌科、类芽胞杆菌属。本专利技术所述类芽胞杆菌HB172198是由褐藻附生菌中分离筛选得到。本专利技术的上述第二个目的是通过以下技术方案来实现的：一种褐藻胶裂解酶，采用上述的类芽胞杆菌菌株HB172198发酵制得。上述的褐藻胶裂解酶的制备方法，优选包括以下步骤：(1)菌株活化：将上述的类芽胞杆菌HB172198接种于固体培养基，于28～37℃培养24～48h，得活化的菌株；(2)液体培养：将活化的菌株接入液体种子培养基中，于28～37℃、120～200r/min振荡培养12～24h，制成种子液；(3)发酵培养：将种子液按体积百分含量为2～10％接种于液体发酵培养基中，于28～37℃、150～200r/min振荡培养24～60h，收集发酵液，离心，收集上清液得褐藻胶裂解酶粗酶液。在该褐藻胶裂解酶的制备方法中：步骤(1)中所述的固体培养基优选为海藻酸钠2216E固体培养基。该海藻酸钠2216E固体培养基的组成为：海藻酸钠2～15g/L，蛋白胨3～10g/L，酵母粉0.5～5g/L，氯化钠5～35g/L，琼脂粉18～20g/L，pH6.5～7.8，以蒸馏水配制。该培养基中添加了海藻酸钠，能促进细菌产生褐藻胶裂解酶。步骤(2)中所述的液体种子培养基和步骤(3)中所述的液体发酵培养基优选为海藻酸钠2216E液体培养基。该海藻酸钠2216E液体培养基组成为：海藻酸钠2～15g/L，蛋白胨3～10g/L，酵母粉0.5～5g/L，氯化钠5～35g/L，pH6.5～7.8，以蒸馏水配制。本专利技术的上述第三个目的是通过以下技术方案来实现的：上述的类芽胞杆菌菌株HB172198以及褐藻胶裂解酶在降解褐藻中的应用。褐藻优选包括马尾藻、海带等褐藻种类。本专利技术具有如下优点：(1)本专利技术中的类芽胞杆菌菌株HB172198，该菌株能够有效降解褐藻胶，还可作为一种新的褐藻胶裂解酶产生菌，也可直接用于褐藻生物降解的微生物资源。(2)本专利技术中的褐藻胶裂解酶，该褐藻胶裂解酶能有效降解褐藻胶，本专利技术中的褐藻胶裂解酶的制备方法，工艺成熟，能获得大量的褐藻胶裂解酶。(3)本专利技术中的类芽胞杆菌菌株HB172198以及褐藻胶裂解酶能用于降解褐藻胶和马尾藻、海带等褐藻。附图说明图1为实施例1中获得菌株HB172198的电镜照片；图2为实施例2中菌株HB172198的基于16SrDNA的系统发育树；图3为实施例5中菌株HB172198粗酶液降解海藻酸钠形成寡糖的薄层层析图谱，其中1为标准品(单糖、三糖和五糖)、2～8分别为第2、6、10、14、20、36、48h的酶解样品。下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明：具体实施方式实施例1类芽胞杆菌HB172198CGMCCNo.15412的分离与筛选褐藻样品采集于海南省文昌市淇水湾近海。取10g样品，无菌状态下剪碎、溶浆，置于装有90mL无菌水及玻璃珠的250mL锥形瓶中，置于28℃、200r/min的恒温摇床中振荡30min，静置5min后，取上清液进行10倍梯度稀释，稀释成10-1～10-3的系列悬液。采用80℃水浴处理20min的方法以杀死非芽胞细菌，吸取系列悬液0.1mL，涂布于褐藻胶裂解酶分离培养基，置于30℃培养箱倒置培养2～5d。待菌落长出时，根据菌落形状、颜色、边缘状态、透明度、表面干湿状态等表型特征，挑取生长好、形态不同的菌落进行划线纯化。对分离获得的芽胞杆菌进行褐藻胶裂解酶活力测定，筛选出酶活性较强的芽胞杆菌HB172198。具体过程如下：用灭菌牙签挑取待检测菌株点接到褐藻胶裂解酶活性检测培养基上，30℃培养2d。待平板上长出明显的菌落后，测量菌落直径(d)。在平皿中加入1mol/L的CaCl2溶液，静置30-60min。待平板上显现出水解圈后，测量水解圈直径(D)，以水解圈直径和菌落直径的比值(D/d)作为初筛指标。其中芽胞杆菌HB172198的D/d值为10.5，活性明显。所用到的培养基配方如下：褐藻胶裂解酶分离培养基：海藻酸钠5g，酵母粉1g，蛋白胨5g，磷酸高铁0.01g，琼脂18g，以海水定容至1L，pH7.6。褐藻胶裂解酶活性检测培养基：海藻酸钠5g，(NH4)2SO45g，K2HPO42g，NaCl20g，MgSO4·7H2O1g，FeSO4·7H2O0.01g，琼脂18g，以海水定容至1L，pH7.6。实施例2类芽胞杆菌HB172198CGMCCNo.15412的种属鉴定菌株HB172198CGMCCNo.15412在221本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种类芽胞杆菌菌株HB172198，其特征是：该菌株HB172198的分类命名为:类芽胞杆菌(Paenibacillus sp.)，保藏编号为：CGMCC No.15412，保藏日期为：2018年03月05日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
【技术特征摘要】
1.一种类芽胞杆菌菌株HB172198，其特征是：该菌株HB172198的分类命名为:类芽胞杆菌(Paenibacillussp.)，保藏编号为：CGMCCNo.15412，保藏日期为：2018年03月05日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。2.一种褐藻胶裂解酶，其特征是：采用权利要求1所述的类芽胞杆菌菌株HB172198发酵制得。3.权利要求2所述的褐藻胶裂解酶的制备方法，其特征是包括以下步骤：(1)菌株活化：将权利要求1中的...
【专利技术属性】
技术研发人员：鲍时翔，黄惠琴，郑志国，朱军，邹潇潇，胡永华，刘敏，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：海南,46
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